二甲基砷酸盐缓冲剂在蛋白质晶体学中新应用的研究

Although cacodylic buffer is widely used in protein purification and crystallization, people have not paid much attention to its other functions during research. In fact, according to statistics in Protein Data Bank (PDB), nearly 3500 protein structure entries have cacodylic buffer in their crystallization conditions, and over 200 models have located cacodylic coordinates in their structures. More importantly, in 67 PDB entries cacodylic acid molecules were covalently bound to cysteines on protein surface. All these data proved that the cacodylic buffer would be a potential candidate in protein structure determination...The most powerful method in de novo protein structure determination is using anomalous signal generated by Se-Methionines (Se-Mets), which were genetically incorporated into protein. In contrast, arsenic, the potential anomalous scattering factor, was overlooked for a long time. Actually, arsenic locates besides selenium in the periodic table and they shared similar f prime and f double prime in their own absorption edge (Theoretically the absorption edge of As is about 1.04?, while Se is about 0.98?). It is very convenient to collect arsenic anomalous signal in a Se-dedicated synchrotron beamline. The modification of cacodylic buffer on cysteines could be an important way to incorporate arsenic into protein...We hoped to develop this method to make full of cacodylic buffer in protein crystallography.

二甲基砷酸盐作为蛋白质纯化和结晶的缓冲溶液得到广泛使用，而其它方面的特点则很少被触及。蛋白质结构数据库（PDB）中的统计值显示，有近3500个蛋白质的结晶条件中使用了二甲基砷酸盐，超过200个结构模型中包含了二甲基砷酸盐，其中67个结构中二甲基砷酸盐与蛋白表面的半胱氨酸以共价键形式相结合。 这些统计数字说明二甲基砷酸盐存在着作为蛋白质表面半胱氨酸的共价修饰的潜在可能，特别是其中含有的砷元素对于蛋白质晶体学结构解析有着更为特殊的意义。.与砷元素同一周期的硒元素可以通过硒代甲硫氨酸的方式被引入到蛋白质结晶学中，成为蛋白质结构解析最重要和最广泛的反常信号来源。砷元素与硒元素反常信号的特征相似，并可以通过共价修饰半胱氨酸方式很容易地被引入蛋白质中，这使得二甲基砷酸盐具有通过反常散射信号解析蛋白质晶体相位的潜力。.希望通过此项研究实现二甲基砷酸盐特异性修饰在蛋白质晶体数据解析中发挥作用。

二甲基砷酸是人们在蛋白质纯化过程中以及蛋白质结晶过程中常用到的缓冲剂之一。虽然长期使用，但是二甲基砷酸盐可能起到的巨大影响始终处于被忽视的状态。其一二甲基亚砷酸可以修饰蛋白质表面的半胱氨酸，这为人们确定蛋白质晶体相位提供了一个非常有力的且有效的手段。其次二甲基砷酸盐作为无机砷元素在人体内代谢的中产物，其体内反应的机理没被系统研究过，特别是没有结构生物学手段对于其微观分子机制进行研究。这也就意味着二甲基砷酸、二甲基亚砷酸存在的对于使用者的危害没有获得重视。..在本课题研究过程中，一方面利用二甲基砷酸盐的修饰特性将HIV 整合酶的活性结构域进行了重新解析，证明该项工作的可行性，后又将该方法利用于新的无同源结构的解析过程中获得成功。其次，为了扩展该方法，合成了二甲基砷酸盐类似物氯二甲基亚砷，也在本项目研究蛋白上获得成功，同时建立了快速检测氯二甲基亚砷的方法。..另一方面，对于砷元素作用于蛋白质的机理进行了研究。通过以往研究表明，砷元素作用机理是占据以金属为活性中心的蛋白质的作用位点。在本项目研究中，选择以锌离子为活性中心的基质金属蛋白酶为靶点。通过实验证明，砷离子可以对于MMP蛋白有一定的抑制作用，但是与其它金属离子相比并不显著。这意味着砷离子作用方式有特殊性，即对于半管氨酸的存在数量有依赖性。另外，本项目还选取砷元素体内代谢途径中最为重要的砷酸甲级转移酶作为研究对象进行了结构生物学研究。..通过本课题研究，加深了我们对于砷元素以及其化合物分子与蛋白质作用机理以及机制理解。