以秀丽隐杆线虫作为寄生虫耐药模型的研究

本项目通过研究抗寄生虫药物诱导模式生物秀丽隐杆线虫耐药模型，探讨寄生虫对药物的耐药机理及逆转耐药的方法。实验研究选择抗蠕虫药物阿苯达唑、甲苯咪唑、三氯苯哒唑、吡喹酮和伊维菌素等，抗疟原虫药物氯喹、青蒿素和蒿甲醚等，作为诱导秀丽隐杆线虫耐药模型的药物，通过药物浓度梯度的递增变化在一定的时间里分别诱导这些药物稳定的耐药模型。通过基因测序、实时定量PCR和RNA干扰等方法检测与耐药有关的基因包括微管蛋白基因、Pgp蛋白基因和MDR基因的变化，分析这些药物与耐药基因变异的关系。同时通过秀丽隐杆线虫耐药模型筛选抗寄生虫药物联合使用的配对方法、耐药逆转剂联合抗寄生虫药物的配对方法和中药耐药逆转剂，并通过耐药基因的检测，分析逆转耐药的机理。本课题通过秀丽隐杆线虫耐药模型的建立，研究寄生虫的耐药机制；同时通过该模型筛选有效延缓寄生虫耐药的药物配对方法，筛选新的有效的寄生虫耐药逆转剂。

通过不同浓度青蒿素和5-氟尿嘧啶作用秀丽隐杆线虫，诱导耐药模型，同时观察秀丽隐杆线虫的生存周期、繁殖及相关基因表达的变化，探讨青蒿素影响秀丽隐杆线虫生殖的机理。以小剂量青蒿素累计诱导秀丽隐杆线虫耐药模型；同时以致死剂量的青蒿素和致生殖缺陷的5-氟尿嘧啶处理秀丽隐杆线虫，在体视显微镜下观察线虫的寿命以及产卵情况。提取5mM青蒿素组和20uM5-氟尿嘧啶组线虫RNA；青蒿素组线虫RNA反转录成cDNA后进行荧光定量PCR实验，比较sec-23，lin-29和ung-1等基因表达的差异性；5-氟尿嘧啶组线虫RNA应用数字基因谱技术进行全基因组表达谱测定，并用荧光定量PCR验证。3mM、4 mM和5mM青蒿素组线虫生存天数分别为5.65天，5.25天和4.65天，与正常组比较有统计学意义（P<0.05）；各青蒿素组线虫都没有产卵或后代出现；5mM青蒿素组的线虫sec-23表达下调，lin-29与ung-1表达均上调。5uM和10uM的5-氟尿嘧啶组后代数要少于对照组（P<0.05），但比20uM的后代数要多（P<0.05）。数字基因谱显示，20uM 5-fu组有1147基因上调，1067基因下调；有101 genes上调基因的log2Radio值大于8，有141下调基因大于8。按照KEGG database检索，对5-fu组不同表达基因的识别和信号通路进行了分析，发现主要有20个差异表达的基因参与TGF-beta信号通路(ko04350，Q=0.003)和ECM-receptor interaction通路(ko04512，Q=0.000067)。还有些基因参与Focal adhesion 通路(ko04510，Q=0.00004，Hypertrophic cardiomyopathy通路(ko05410，Q=0.00006)。通过real-time RT- PCR对者20个表达富集的基因进行验证，发现有19个基因被证实表达有差异。由于诱导秀丽隐杆线虫耐药模型的出现周期比较长，实验还在继续中。结论 青蒿素能够缩短秀丽隐杆线虫的寿命，抑制线虫的生殖，其机理可能与sec-23，lin-29和ung-1的调控有关。5-氟尿嘧啶可以导致秀丽隐杆线虫出现生殖缺陷，其机理可能与参与TGF-beta和ECM-receptorinteraction等信号通路的daf-14等基因的调节有关。