维生素D3前体生物合成关键酶胆固醇7-脱氢酶系的构效研究

7-dehydrocholesterol, which is catalyzed by 7-dehydrogenase and reductase, is key process in biosynthesis of vitamin D3 precursor. However, the structure and function of 7-dehydrogenase and the related enzymes is still unclear. This limits the development of cholesterol industry. In order to elucidate the catalytic mechanism of cholesterol 7-dehydrogenation and its electron transfer pathway between reductase, and to uncover the ‘black box’ of the cholesterol dehydrogenation catalyzed by 7-dehydrogenase during cholesterol metabolic pathway, we will identify the function of reductase based on the structural and biochemical analysis. The crystal structures of 7-dehydrogenase, together with its reductase complex will be determined by X-crystallography. We will firstly elucidate the reaction mechanism toward 7-dehydrogenation and the electron transfer pathway among related enzymes by analyzing structural basis of active site. The relationship of the structure and function will be explained based on the crystal structures. The enzymatic characterization will be carried on by determining the optimal reaction conditions, such as catalytic efficiency and substrates specificity. Furthermore, the industrial catalysts will be created based on the structure information using the rational engineering and site-directed mutagenesis. The results will provide theoretical basis for the microbial conversion of 7-dehydrocholesterol and the design industrial catalysts for biosynthesizing food functional components of vitamin D3.

胆固醇7-脱氢酶催化胆固醇生成7-脱氢胆固醇，是维生素D3合成的关键步骤，但目前该酶的结构和催化功能尚不明确，严重限制了胆固醇产业链的延伸。为了阐明胆固醇7-脱氢酶催化反应机制以及参与电子传递的铁氧化还原酶系的结构和功能关系，解决7-脱氢酶体系的催化反应“黑箱”问题，本项目拟通过结构生物学与生物化学的方法，鉴定脱氢反应相关还原酶系的功能。通过解析胆固醇7-脱氢酶及还原酶复合体的三维立体结构，阐明胆固醇7-脱氢酶促催化反应机制以及相关还原酶系间的整个电子传递、协同作用过程。基于结构生物学信息研究胆固醇7-脱氢酶催化效率、底物特异性等酶学性质，进行理性设计与定点突变，在分子水平上解析胆固醇7-脱氢酶在结构与功能上的构效关系，为新型高活性的生物催化剂的设计与胆固醇生物转化合成食品功能营养因子维生素D3提供理论依据。

7-脱氢胆固醇是一种合成维生素D3的前体物，在人体皮肤上经阳光中的紫外线照射，可以直接进行合成转化。本项目对果蝇、秀丽隐杆线虫来源的胆固醇7-脱氢酶Neverland进行了功能鉴定。Neverland（NVD）家族基因编码为保守的Rieske型加氧酶，负责类固醇激素的合成和调节过程中的脱氢作用。本项目重新构建了MBP-NVD-His表达体系，并成功实现了NVD蛋白在大肠杆菌中的可溶表达。在胆固醇类物质降解途径中甾体化合物的羟基化反应是最重要的反应之一，针对目前9α-OH-AD的产率低转化效率较低等问题，验证了KSH系统中还原酶KshB是反应体系中的限速酶。筛选了不同来源的铁氧还蛋白还原酶，得到高活性还原酶TDO。另外，将甲酸脱氢酶（FDH）引入反应体系中使辅酶NADH再生循环。优化发酵工艺参数提高了9α-OH-AD的产量。为了进一步阐明铁氧化还原蛋白中铁硫簇的功能及构效关系，本研究选取了催化效率最高的多酶催化反应体系进行了蛋白质-蛋白质相互作用分析，并基于电子分叉理论，验证了游离铁硫簇Fdx为电子从还原酶到氧化酶创造了一个新的电子通道。此外本项目以来源于简单节杆菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶KsdD、胆固醇氧化酶PsCO为研究对象，过对KsdD、PsCO的三维结构分析，选取与底物结合相关的重要氨基酸进行理性改造，拓宽酶的底物识别谱并提高其催化反应效率。因此本项目研究成果是基于胆固醇氧化酶、胆固醇7脱氢酶、甾体1，2脱氢酶及还原酶的筛选、甾体酶的定向改造以及还原酶上铁氧还原蛋白的修饰多策略提高了甾体羟基化的催化效率，增强了催化体系中电子的传递效率；同时该成果亦可为其他甾体高效的催化反应提供了新的思路。