早酥梨红皮芽变突变的分子机制及相关基因的克隆和功能研究

红皮梨育种是国际梨育种的一个主要目标。梨红皮性状突变机制及其相关基因的克隆和功能研究对于红皮梨分子育种具有重要意义。理想红皮梨种质相对匮乏，早酥梨红皮芽变是开展其研究的理想材料。.本研究以特有的早酥梨红皮芽变和母株为试材，一方面利用抑制性差减杂交技术，构建差减文库，筛选差异表达克隆进行序列测定和分析，鉴定和分析差异表达基因，然后选取相关ESTs进行表达分析,扩增相关基因全长cDNA并构建载体转化烟草进行功能验证；另一方面利用差异蛋白组学技术，提取材料蛋白质和IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳分离蛋白质，利用肽质量指纹谱和生物信息学方法鉴定差异蛋白质，获取与红皮性状相关的标志性蛋白质并进行表达和功能验证。项目比较芽变与母体间的mRNA 和蛋白质以获得差异表达的基因克隆和蛋白质，分析突变发生的分子机制，同时进行相关目的基因克隆和功能研究，为梨红皮性状遗传和红皮梨分子育种研究奠定基础。

梨红皮性状突变机制及其相关基因的克隆和功能研究对于红皮梨分子育种具有重要意义。本研究以‘早酥梨’及其红皮芽变‘红早酥’为试材，一方面构建了cDNA差减文库，发掘出3个与芽变相关的重要基因（BEL1-like同源转录因子、逆转录转座子和核染色体重组亚基）、7个与花青素合成相关的基因（MYBR转录因子、bHLH转录因子等）。另一方面，建立了高质量的梨叶片、果皮及果肉蛋白质组双向电泳体系，筛选鉴定出93个差异蛋白序列，结合定量分析结果，发掘出6个潜在芽变相关基因（TCTP protein、MYB结构域转录因子（MYB3）、WHY结构域转录因子等）。.为了克服差异蛋白组和抑制消减文库难以检测低表达基因的技术瓶颈，本研究从花青苷代谢水平和合成基因水平着手，首先利用高效液相色谱与质谱连用技术，定性和定量了两个梨品种果皮中的花青苷及其他17种相关类黄酮组分，结合偏相关分析与多重线性回归模拟，确定了代谢层面中的芽变关键节点在于黄酮醇3-半乳糖苷代谢支路的变异。同时，分离和克隆了4个花青苷合成基因CHS、F3H、DFR、UFGT的cDNA编码区序列，定量PCR分析显示 ‘红早酥’中大部分基因的表达量要高于‘早酥梨’，其中结构基因UFGT的差异最为显著；结合花青苷代谢模式的分析结果，明确了花青苷合成酶（结构基因）中，可能造成红色芽变的关键基因为UFGT，该结果也经过了酶活实验的再次验证。.为了研究关键基因UFGT的转录与调控，克隆获得了UFGT约2000bp的启动子片段，序列分析显示，该序列存在较多MYB识别的顺时作用元件，因此结合消减文库和差异蛋白组的分析结果，选择了差异表达的MYB转录因子MYBR和MYB3作为切入点，从‘早酥’和‘红早酥’果实中克隆了PbMYBR基因和PbMYB3基因；分析了两个基因在两个品种果实中表达量，结果表明两个基因与果实红色表型相关；构建了pWR306-PbMYBR和pCambia1301-PbMYB3植物表达载体，通过叶盘法转化梨幼叶，以及在早酥幼果上进行了瞬时表达实验，结果表明PbMYBR基因和PbMYB3基因均能够正调控花青苷的合成 。本研究明确了代谢层面的黄酮醇3-半乳糖苷代谢支路、花青苷合成酶层面的UFGT、转录因子层面的MYBR和MYB3为芽变在不同水平上的关键节点，为进一步深入研究梨红皮着色机理和红皮梨分子育种研究奠定了多层次的理论基础。