miR-33对肝脏脂类代谢和脂肪沉积机制研究

microRNAs(miRNAs) are a class of ～22 nt small noncoding RNAs, post-transcriptionally regulating genes by binding to specific sites in the 3′-UTR of mRNAs. Liver is an important organelle for lipid metabolism in chicken. Many genes including miRNAs are involved in the regulation of lipid metabolism, miR-33 is one of them. In this study, the bioinformatics and reporter gene assay will be combined to identify its target genes. Transfection of LNA-anti-miR-33 or miR-33 mimics into chicken hepatocytes to decrese or increse the experssion of miR-33, respectively, several potential target genes will be chosen to be validated using dual luciferase reporter system and Western Blotting, and the function of miR-33 in lipid metabolism of chicken will be analyzed, considering the functions of target genes. Furthermore, we will test the change of the body after lentiviral infection of miR-33. The regulatory mechanism of lipid metabolism and fat deposition of chicken will be explored from another angle in this study.

miRNA主要通过与靶基因mRNA的3'-UTR区结合来实现转录后调控。鸡肝脏是脂类代谢的重要场所，脂类代谢过程涉及了许多基因，也受到miRNA的调控，miR-33便是其中之一。本项目中，我们将利用生物信息学和报告基因的方法手段证实miR-33调控靶基因的表达；同时利用转染Anti-miRNA的方法和miR-33 mimics，分别抑制和过表达鸡肝脏细胞中miR-33的表达量，利用体外双荧光素酶报告系统和Western Blotting等检测靶基因，结合靶基因的功能来分析miR-33在鸡肝脏脂肪代谢中的作用，此外，通过构建miR-33慢病毒表达载体，活体注射后，检测miR-33过表达后机体的变化。通过该项目的实施，从另一角度探讨鸡脂类代谢和脂肪沉积的调控机理。

农业动物体内脂肪组织数量的调控是畜牧业中备受关注的重要问题。与哺乳动物不同的是，鸡脂类从头合成主要是在肝脏中完成而非脂肪组织。由此，了解miR-33是如何调控脂肪酸在鸡肝脏中的积累显得非常有必要。miR-33是定位于固醇调节元件结合转录因子2(SREBP2)的内含子microRNA，而SREBP2是激活许多参与胆固醇、甘油三酯、脂肪酸和磷脂摄取和合成基因的开关。本研究旨在探讨鸡miR-33 对肝脏脂类代谢的影响。首先利用生物信息学方法，通过miRNA靶基因预测软件“miRanda”和“TargetScan”共预测到378 个miR-33 的靶基因，包括脂肪酸氧化的关键基因CROT和HADHB；进一步构建miR-33 过表达载体和CROT、HADHB荧光素酶报告载体，共转染细胞后荧光素酶报告基因结果显示，miR-33 的种子区与CROT、HADHB 预测靶位点结合，CROT、HADHB基因表达被抑制；点突变实验证实了miR-33 与CROT、HADHB结合的靶位点。设计并合成miR-33 拮抗物LNA -antimiR-33，转染鸡原代肝细胞后使miR-33表达水平下降44%，而CROT、HADHB基因mRNA和蛋白水平显著上升；与此相反，鸡肝细胞中过表达miR-33后CROT、HADHB基因mRNA和蛋白水平显著下调，细胞内氧化水平显著下降，细胞内甘油三酯含量显著升高；体内过表达miR-33后，肝脏中甘油三酯的含量同样显著升高；利用qRT-PCR技术对miR-33 和CROT、HADHB在不同发育时期肝脏中的表达进行分析，结果显示，miR-33 在不同时期肝脏中的表达量均呈先升高后下降再升高的趋势，而靶基因CROT和HADHB在不同时期肝脏中的表达趋势与 miR-33 相反，miR-33 与靶基因的表达量呈中度负相关。上述实验结果提示，miR-33 通过负向调控CROT和HADHB的表达，从而调控脂肪酸氧化，进而影响鸡脂类代谢和脂肪沉积。此研究为揭示鸡脂类代谢调控机理提供了新的线索。