RYBP：一个新的抑癌基因在肝癌发生与治疗中的作用及其分子机制

RYBP is a novel tumor suppressor. It induces tumor cell-specific apoptosis, but has no effect on normal cell types, and has been proved to have a decreased expression in several tumor tissues. Our previous study with a small number of clinical specimens showed that RYBP had a significantly reduced expression in liver cancer tissues comparing with adjacent normal tissues at both mRNA and protein levels, but the underlying molecular mechanism is unknown. We also found that recombinant RYBP protein in prokaryotic expression system induced lung cancer cell line A549 apoptosis, and in addition we have identified two new RYBP-binding proteins using yeast two hybrid method. In this study, we will try to elucidate the relationship between RYBP and hepatocarcinogenesis in the following several aspects. Firstly, we will enroll more clinical liver cancer patients to investigate the association between RYBP mRNA level and various of clinical related outcomes of liver cancer. Secondly, we will try to further make clear of the identity of RYBP as a tumor suppressor both in vitro and in vivo. Thirdly, we will treat liver cancer cells and liver cancer cell-bearing nude mice with recombinant protein or lentivirus vector-mediated gene therapy of RYBP to check its effect on liver cancer cell proliferation, apoptosis and growth inhibition. Fourthly,we will investigate the molecular mechanisms of down-regulation of RYBP in liver cancer cells and tissues mainly focusing on gene dosage alteration, promoter activity and mRNA stability of RYBP. Finally, we will employ yeast two hybrid method to finish full scale screening of novel RYBP-interacting protein in order to further understand the molecular functions of RYBP. Totally, this study will lay a solid foundation for the roles of RYBP on hepatocarcinogenesis and RYBP-targeted liver cancer treatment in the future.

RYBP是新发现的一个抑癌基因，能够诱导肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞毒性低，已证明在几种肿瘤组织中表达降低。我们前期小标本量研究发现，RYBP在肝癌中的mRNA和蛋白质水平均降低，但机理不明；也发现原核表达的RYBP重组蛋白对培养的肺癌细胞有凋亡诱导作用；还应用酵母双杂交方法发现了两个新的RYBP结合蛋白。本研究将在前期工作基础上扩大肝癌样本量，分析RYBP mRNA水平与肝癌病人各项临床相关指标的关系；利用细胞实验和荷瘤裸鼠模型进一步鉴定肝癌中RYBP的肿瘤抑制子身份；研究RYBP重组蛋白和慢病毒载体介导的基因治疗对肝癌细胞和移植肿瘤增殖和凋亡的影响；从基因剂量、启动子活性和mRNA稳定性等方面探讨RYBP在肝癌中低表达的分子机制；还将利用酵母双杂交系统全面筛选RYBP新的结合蛋白，发现其新功能。总之，该研究的实施将对肝癌的发病机制及治疗提供新视角，有着理论研究价值和潜在的临床应用前景。

RYBP参与多梳蛋白复合物组成，对于维持组织器官的正常发育必不可少。同时， RYBP也是一个新的肿瘤抑制子，能够特异性促进肿瘤细胞的凋亡，抑制移植瘤的生长，在多种人类肿瘤组织中的表达降低。因此，发现RYBP新的分子功能，探讨其在肿瘤组织中表达降低的分子机制，对于阐明肿瘤发病机制，寻找以RYBP为靶点的抗肿瘤药物有重要意义。.首先，我们应用酵母双杂交方法筛选到一个新的与RYBP相互作用的蛋白质——FANK1，并利用其它分子生物学方法证明该相互作用。进一步的研究发现，RYBP结合并抑制多聚泛素化FANK1的蛋白酶体降解，稳定FANK1的蛋白质水平。功能性分析发现，RYBP与FANK1的相互作用激活JNK-AP-1信号通路，促进肿瘤细胞凋亡。这一研究发现，丰富了我们对于RYBP诱导肿瘤细胞凋亡分子机制的认识。.过表达的RYBP主要定位于细胞核，但RYBP入核的分子机制未知。因此，我们利用生物信息学技术结合分子生物学方法，在RYBP蛋白质中鉴定到三个核定位信号。在此基础上，通过将三个核定位信号中的四个碱性氨基酸突变为丙氨酸，得到胞质定位的RYBP突变体。进一步的研究发现，该突变体比野生型RYBP有更强的抑制肿瘤细胞周期进展，促进肿瘤细胞凋亡的能力。这一研究成果为靶向RYBP的抗肿瘤药物的研发提供新的思路。.我们前期的研究发现，RYBP在肝癌组织中的mRNA和蛋白质水平显著低于癌旁对照组织，但降低发生的分子机制未知。因此，我们对其在肝癌组织中表达下调的分子机制进行了研究。结果表明，RYBP mRNA水平的降低与基因拷贝数、自身启动子区的序列变异或多态性、以及启动子区CpG的甲基化状态等无关。进一步的研究发现，转录因子KLF4和Sp1分别结合Rybp基因的启动子区，前者激活而后者抑制Rybp的表达，并证明RYBP参与调节KLF4和Sp1对肝癌细胞生长的抑制或促进作用。利用临床肝癌组织标本的分析发现，与癌旁对照组织相比，RYBP和KLF4在肝癌组织中的表达降低，而Sp1在肝癌组织细胞核中的表达增高，RYBP与KLF4的表达水平间呈正相关关系，而与核Sp1间呈负相关关系，提示KLF4和Sp1的异常表达可能是RYBP在肝癌组织中表达降低的主要原因。我们的该研究结果为靶向KLF4-RYBP和Sp1-RYBP的肝癌治疗药物的研发提供新的线索。