不同环数的多环芳烃对海洋鱼类早期骨骼发育的影响及其分子机制

已有关于多环芳烃对鱼类的发育毒性的报道显示，作为芳烃受体的微弱激动剂的2-4环的多环芳烃具有明显的发育毒性，但其作用机理尚不清楚。本项目拟采用环境污染水平的多环芳烃对海洋鱼类的胚胎和仔鱼进行暴露，通过实验观察，比较二环、三环、四环、五环的代表性多环芳烃对海洋鱼类早期生活阶段发育的影响，比较它们引起鱼类胚胎骨骼发育缺陷的阈值和毒性大小；应用分子生物学技术，如基因克隆、RT－PCR、组织学观察、免疫组织化学等，研究多环芳烃对有关骨骼发育的基因、信号分子及相关酶活性的作用，观察靶分子的时间－效应和剂量－效应，探讨多环芳烃导致鱼类骨骼发育畸形的途径和机制；为分析和评价PAHs对海洋鱼类生物种群资源的影响，为海洋渔业资源的保护提供科学资料；为制定环境保护政策和标准提供依据。同时也为致畸化学物的监测寻找新的生物标志物。

本研究采用三环的菲(Phe)和四环的芘(Pyr)以及五环的苯并(a)芘(BaP)分别暴露褐菖鮋胚胎，研究PAHs对海洋鱼类胚胎发育的毒性效应和机制。.海洋鱼类-褐菖鮋的仔鱼暴露于PAHs8天后，仔鱼的发育状况，死亡率、畸形率呈现浓度依赖性上升；畸形主要表现为脊柱弯曲和卵黄囊和心包囊水肿。通过检测胚胎Na＋，K＋－ATP酶和Ca2＋－ATP酶的活性，相关性分析显示Na＋，K＋－ATP酶活性的抑制是心包囊和卵黄囊水肿的原因之一；Na＋，K＋－ATP酶和Ca2＋－ATP酶的活性的抑制是骨骼发育缺陷的重要原因。.BaP、Pyr和Phe暴露后的褐菖鮋胚胎颅面骨发育受到明显的抑制，胚胎的下颌骨和舌弓软骨都出现弯曲变短现象，并呈现出明显的浓度依赖性。三种PAHs暴露后Sox9a在麦克氏软骨（下颌骨）和胸鳍基芽表达量下降，Caspase-3活性在Phe和Pyr暴露后都被抑制。BaP暴露导致Shh在神经管、下颌软骨和角鳃软骨表达量减少。Ptch1和Gli2表达量也是随着暴露浓度上升而下降，并且下颌骨和鳃骨处PCNA表达量下降。这些结果表明BaP通过降低褐菖鮋胚胎Shh信号通路基因的表达而影响软骨细胞的增殖和软骨形成，最终导致颅面骨骼结构发生异常。芘抑制褐菖鲉胚胎的骨骼发育，导致颅面骨骼元素减少，发育延缓；原位杂交结果显示PCNA、Col2a1和Sox9在颅面骨上的表达下降，说明芘通过抑制骨细胞的增值影响骨骼的发育；同时芘暴露降低了赖氨酸氧化酶基因（LOX1）的表达水平和赖氨酸氧化酶的活性，可能影响软骨中胶原的交联，从而影响骨骼发育。.BaP和Pyr暴露都会改变颅面神经分布，神经分布遭到破坏，神经轴突伸向异常的区域，并且发现前端和后端神经节缩小。神经分支明显变细变短。高浓度BaP暴露导致仔鱼侧线神经丘数目减少。BaP和Pyr都能够降低一氧化氮(nitric oxide, NO)的水平，却不影响一氧化氮合酶(NOS)的活性。但是对于乙酰胆碱系统，Pyr是增高乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)水平从而抑制神经生长和突触的发育，而BaP正好相反，它通过降低ACh水平和乙酰胆碱转移酶(Choline acetyltransferase, ChAT)活性，增高乙酰胆碱酯酶(AChE)活性影响神经系统的发育。在对钙调蛋白信号通路影响方面，Pyr激活下游的CaMKII和CREB，