EGCG抑制肝星状细胞活化减轻肝癌放疗促转移潜能的实验研究

How to prevent recurrence and metastasis of hepatocellular carcinoma after radiotherapy is the main problem in improving the curative effect of radiotherapy in patients with advanced liver cancer. Clinical and laboratory studies have shown that radiotherapy has the potential to promote residual cancer metastasis and is the main source of recurrence. It is closely relate to the changes of tumor microenvironment after radiotherapy. The preliminary study shows that radiotherapy can activate hepatic stellate cells, but the specific mechanism remains to be further clarified. EGCG has a significant anti-tumor and anti-inflammatory effect as a water-soluble monomer extracted from traditional Chinese tea by using modern technology. Therefore, this project is to study the changes of tumor microenvironment after hepatocellular carcinoma radiotherapy and the interaction between hepatocellular carcinoma cells and hepatic stellate cells. The mechanism of metastatic potential of hepatocellular carcinoma cells is explored from the cell and molecular level in vivo and in vitro, Reveal its role in the signal pathways, key molecules and regulatory mode. It is clear that EGCG enhances the effect and intervention target of SBRT radiotherapy in hepatocellular carcinoma by inhibiting the activation of hepatic stellate cells, and finds an effective method to improve the cure rate of hepatocellular carcinoma.

如何预防肝癌放疗后复发和转移是提高中晚期肝癌患者放疗疗效面临的主要难题。有临床和实验室研究表明放疗有促进残癌转移的潜能，也是复发的主要根源，与放疗后肿瘤微环境改变密切相关，本课题组前期研究显示放疗可以活化肝星状细胞，但具体机制仍有待进一步明确。EGCG作为一种采用现代工艺从我国传统茶叶中提取的水溶性单体，具有显著的抗肿瘤和抗炎效果。因此，本项目拟研究肝癌放疗后肿瘤微环境的变化以及肝癌细胞与肝星状细胞间的相互作用关系，通过体内外实验分别从细胞和分子水平上深入探索放疗促肝癌细胞转移潜能的机制，揭示其作用的信号通路、关键分子及调控模式。明确EGCG通过抑制肝星状细胞活化而增强肝癌SBRT放疗的效果和干预靶点，为提高肝癌放疗的治愈率寻找有效的方法。

越来越多的研究表明放疗后的肝脏微环境改变是肝癌放疗后的肿瘤复发和转移的重要因素。我们前期研究发现，放疗激活肝星状细胞（HSC）是肝癌微环境的主要变化之一。因此，我们研究了放疗后活化的肝星状细胞参与促进残留癌细胞的侵袭迁移能力和作用机制。在本研究中，我们先在Transwell小室将人肝癌细胞系与辐照后的人肝星状细胞系（LX2）共培养或加入辐照后的LX2细胞的培养液上清均能显著增强肝癌细胞的迁移能力，同时，与辐照后的肝癌细胞共培养也可已反过来促进LX2细胞的迁移能力，说明肝癌细胞星状细胞之间的相互作用与细胞因子有关。接下来我们先通过蛋白质谱芯片检测放疗后的LX2细胞样本的差异表达基因，然而高通量结果并未筛选到与HSC活化相关的关键基因和信号通路分子。通过流式检测发现辐照后LX2细胞培养上清中的炎症因子IL-6与趋化CX3CL1显著增高，根据细胞因子的分泌特性与HSC表达的几种活化配体，我们选择了TLR4信号通路相关分子做进一步研究。结果表明辐射不仅增强了LX2细胞和小鼠原代肝星状细胞的活化，还上调了TLR4、ICAR1、67kD LR蛋白表达，并下调TLR4负调控蛋白Tollip的表达。此外，研究结果还发现EGCG能结合67kD LR抑制TLR4信号通路活化从而抑制LX2的活化和迁移。另外，蛋白质芯片结果显示放疗后LX2细胞的差异表达的蛋白分子与溶酶体途径和泛素介导的蛋白水解有关，其中放疗后CUL4-DDB1 E3连接酶复合物的底物受体DCAF13表达明显下调，因此我们挑选了DNA损伤结合蛋白1(DDB1)作进一步研究探索。初步结果显示：在LX2细胞株中敲除DDB1后HMGB-1表达增高，且过表达DDB1能抑制HMGB1的表达，提示内源性HMGB1的表达可能受泛素化调控机制影响，当泛素蛋白酶体水解途径被抑制时，细胞内的HMGB1蛋白表达增高。由于HMGB1是TLR4的内源性配体，我们推测放疗后LX2细胞中的DDB1表达下调使得HMGB1去泛素化后表达上调，并活化TLR4信号通路。研究结果初步阐明了放疗活化HSC的途径和活化的HSC促进肝癌细胞侵袭迁移的作用机制，课题项目具有延续性，后续研究将进一步明确放疗引起的DDB1泛素化调控机制在活化的HSC诱导肝癌放疗复发转移中的具体分子机制，寻找增强肝癌 SBRT 的疗效，防治肝癌复发和转移的新方法。