水稻种子休眠性QTL qSdn-5的图位克隆与功能分析

In recent years, preharvest sprouting was very serious phenomenon during rice products in Southern rice region. The previous research showed that the cultivar with strong seed dormancy have high resistant to preharvest sprouting. Therefore, seed dormancy in rice, an important agronomic trait related to rice quality and seed quality, is a quantitative trait controlled by the major gene and multiple genes, and is affected by environmental conditions. To date, the molecular mechanism regulating this trait is not yet understood. In the preliminary study, the applicant had already constructed near-isogenic line carrying the major seed dormancy QTL qSdn-5 (Nanjing 35 as receptor and N22 as donor). Then a secondary segregation population built by near-isogenic line is utilized for high-resolution mapping and the qSdn-5 was localized to a 50 kb region containing eight intact open reading fragments.In this study, based on the method of bio-informatics and sequencing, qSdn-5 gene will be isolated and proceed for function verification by blasting, expression file and yeast two-hybrid assay, and transgene for overexpression and RNAi of candidate genes. The relationship between qSdn-5 and known seed dormancy genes such as OsDOG1、OsSdr4、OsVP1, and traits related to physiological processes of seed dormancy and germination will be analyzed using near-isogenic lines, transgenic plants and mutuants. The results will help us to understand the molecular mechanism of qSdn-5 in rice seed dormancy and preharvest sprouting resistance, and to promote the breeding program of PHS resistance by molecular assitant seletion in rice.

近年来，南方稻区水稻生产穗发芽异常严重，造成重大损失。研究表明休眠性强的品种抗穗发芽，因此，水稻种子休眠性是关系到稻米品质和稻种质量的重要农艺性状，受主基因+多基因控制，且受环境条件的影响，迄今对其调控分子机制了解甚少。在前期研究中，已构建了以南粳35为受体、N22为供体的，携带qSdn-5的近等基因系，利用近等基因系构建次级分离群体，对qSdn-5进行精细定位，将其限制在50kb范围内，含8个完整的ORF。本研究拟在此基础上，结合生物信息学的方法和序列分析，分离克隆qSdn-5基因。对此区间进行测序，通过同源性比较、表达谱分析、酵母双杂以及转基因研究进行功能验证，利用近等基因系、转基因材料及突变体材料，分析qSdn-5与其他控制休眠性基因间（包括OsDOG1、OsSdr4、OsVP1等）的关系，阐明其在水稻种子休眠和萌发控制途径中的作用机制，同时创制休眠性适宜的水稻新材料。

利用休眠性近等基因系NIL（qSdn-5），结合生物信息学方法和序列分析、转基因验证，分离克隆了qSdn-5，发现该基因编码QSOXL1蛋白，在蛋白质二硫键的形成中起作用，亚细胞定位在高尔基体和内质网中，在种子成熟后期及后熟过程中参与蛋白质的修饰，进而调控种子休眠。序列分析发现OsQSOXL1在N22和南粳35中存在一处氨基酸的差异（从赖氨酸到谷氨酸的变异），该差异位于该蛋白氧化还原催化位点CXXC后两个氨基酸处，N22中赖氨酸带正电荷，而南粳35中谷氨酸带负电荷，可能影响QSOXL1的电子传递，进而影响酶活。酶活分析表明N22中QSOX具有较高的氧化还原活性，而南粳35中QSOX酶活性很低。QSOXL1在植物各组织呈组成性表达，但在叶、穗和种子中相对表达量更高，在种子发育过程中，QSOXL1的表达在南粳35和NIL5之间几乎没有差异，随着种子的发育均呈现逐渐增强的趋势，且发现QSOXL1在颖壳中的表达量远高于其在胚和胚乳的表达量。酵母双杂和LCA实验发现QSOXL1与COP9亚基CSN5a存在互作，CSN是一种保守的多亚基蛋白复合物，是泛素E3连接酶Cullin-RING家族的调节因子，QSOXL1可能通过调节CSN5a的功能从而调节休眠。表达分析和外源ABA和GA处理实验表明，ABA和GA对QSOXL1的表达存在一定的抑制，但GA的抑制能力比ABA更强，且QSOXL1敲除突变体对GA更加敏感。分析发现敲除家系的游离巯基水平低于野生型N22，而近等基因系高于亲本南粳35，表明具有活性的QSOXL1蛋白可能会导致细胞氧化水平的降低。RNAseq分析表明，相对于N22，qsoxl1-C1有263个基因表达上调，643个基因表达下调。差异表达基因主要富集在protein processing in endoplasmic reticulum中，含有30个相关基因，且都发生不同程度的上调。QSOXL1的单倍型分析表明，N22属于Hap5，发芽率显著低于其他单倍型，初步阐明了QSOXL1在水稻种子休眠和萌发控制途径中的分子作用机制。此外还克隆了种子休眠基因OsDOG1L-3、WRKY29、OsBT1等，研究了这些基因的功能，定位了杂草稻控制休眠性的基因位点，同时获得种子休眠性紧密连锁或共分离的分子标记，创制休眠性适宜的水稻新材料，为水稻适宜休眠性的分子育种提供基础。