TLRs/mROS信号通路在宿主抗乳房链球菌感染中的作用研究

Streptococcus uberis (S. uberis) is an intracellular pathogen of the mammary gland. Reactive oxygen species (ROS) are essential components of the innate immune response against intracellular pathogen. Mitochondria are stimulated to produce ROS during the infective process and are regulated by specific toll-like receptors (TLRs). In order to elucidate the role of TLRs/mROS signaling pathway in S. uberis infection, bacteria will be co-cultured with target cells (macrophages and mammary epithelial cells). Then, different inhibitors or specific small interfering RNA targeting TLRs (TLR2/4), TGF-β-activated kinase and NADPH oxidases are used to inhibit the relative signaling pathways, and evaluate the effects of TLRs, ROS and mROS on the bacteriocidal ability of the effector cells. The specific TLRs, key adaptor proteins, inflammatory factors, ROS, mROS, the number of intracellular bacteria and cell injury are quantified. Finally, an double gene knockout (TLR2-/-,4-/-) mouse model of S. uberis mastitis will be employed to demonstrate the in vivo antibacterial activity of TLRs/mROS signaling pathway. This study will contribute to a more thorough understanding of the mechanism(s) of immune recognition and clearance of S. uberis infection, and may offer new insights into the prevention and control of economically-important S. uberis mastitis.

乳房链球菌感染后形成胞内感染，而ROS的产生对清除胞内微生物是必需的。在胞内感染形成的过程中病原能有效激发线粒体产生mROS，此效应受特异性TLRs调控。为探讨TLRs/mROS信号通路在宿主抗乳房链球菌感染过程中的作用，研究将乳房链球菌与其靶细胞（巨噬细胞及乳腺上皮细胞）共孵育，通过应用针对TLRs（TLR2/4）、TAK1及NADPH氧化酶的特异性拮抗剂或siRNA阻断/抑制相关信号通路，细胞水平评价TLRs及mROS在宿主抗乳房链球菌感染中的作用。检测内容包括TLRs信号通路上的关键接头蛋白，促炎症因子、ROS、mROS、胞内活菌数及细胞损伤等。最后用TLR2-/-,4-/-双基因敲除小鼠在体验证，达到全面阐明TLRs/mROS信号通路在宿主抗乳房链球菌感染过程中的作用的目的。研究的开展有助于理解宿主识别和清除乳房链球菌感染的天然免疫机制，对乳房链球菌的免疫调控及防治具有重要的意义。

1. TLR2在宿主抗S.uberis感染中的作用.S. uberis灌注诱发两种小鼠（WT、TLR2-/-）乳腺组织PMN浸润、出血、脂肪组织增生及坏死等病理变化。与野生型相比，TLR2-/-小鼠组织损伤更加显著，抗氧化水平、IL-1β等炎性因子显著降低，TLRs信号通路上的关键蛋白（MyD88、TAK1、ECSIT等）的激活显著减弱。说明TLR2在抗S. uberis感染中发挥重要作用。.2. TLR4在宿主抗S.uberis感染中的作用.S. uberis灌注在TLR4-/-诱发与1.中相似的炎症反应。与野生型相比，TLR4-/-小鼠MyD88、ECSIT蛋白表达及TNF-α的分泌显著降低。同TLR2基因缺失相比，野生型同缺失小鼠间变化差异要明显偏弱。说明TLR4在一定程度上参与宿主与S. uberis的互作。.3. 线粒体源ROS在宿主抗S.uberis感染中的作用及与TLRs激活的关系.S. uberis感染激活TLR2、TLR4，提高炎性因子、NAGase、ROS、mROS及TLRs下游蛋白的含量或活性。与TLR4相比，TLR2是主要的模式识别受体。GKT137831、NG25降低ROS、炎性因子的含量，对mROS的含量无影响。说明，在S. uberis感染过程中，TLRs（TLR2/4）可调节ROS的产生，mROS在S. uberis诱发的炎症及清除病原方面发挥着重要作用。.4. 乳房链球菌感染乳腺上皮细胞时PI3K/Akt/mTOR与TLRs/NF-ĸB的互作关系.菌液上清及S. uberis感染均可激活PI3K/Akt/mTOR通路，正向调控炎症反应。抑制mTOR可降低由S. uberis感染引起的炎症反应。抑制剂MK2206与NG25可降低炎性因子的分泌，但NG25对PI3K/Akt/mTOR的激活无影响；说明S. uberis感染激活PI3K/Akt/mTOR，并与TLRs/NF-κB通路存在交互关系。.以上结果说明，TLR2/4介导了相关炎性反应的调控，TLR2是S. uberis主要的模式识别受体。TLRs（TLR2/4）/mROS在调控S. uberis感染的过程中发挥重要的作用，PI3K/Akt/mTOR参与其中并与TLRs/NF-κB交互协调，但PI3K/Akt/mTOR的激活不依赖于TLRs/NF-κB所产生的炎症因子的反馈作用。