Iduna调控Wnt通路在新生大鼠缺氧缺血性脑轴突损伤中的作用

Iduna is a prosurvival ubiquitin ligase that protects the brain from stroke. In a previous study, we identified a severe axonal injury in the hypoxic ischemia（HI）model of neonatal rats. Moreover, Endogenic neuroprotective protein Iduna showed a hypoxic-time dependence downregulation. Downregulation of Iduna decreases expression of axonal marker protein in vitro. However，it is unclear if Iduna plays a role in axonal injury after HI in neonatal rats. Wnt signaling acts a critical role in neuronal axons growth. We found the negative regulatory protein Axin of Wnt pathway was upregulated in neonatal HI neurons. It was reported that Iduna could promote Axin ubiquitylated and degradated in breast cancer cells. Does Iduna downregulation lead to Axin accumulation and further inhibit Wnt signal in axonal damage in neonatal HI injury? And how does it work? In this study, focusing on Axin regulation by Iduna with gene cloning, virus packaging, RNAi, immunoblotting, and CLSM technology, we will explore the effect of Iduna regulating Wnt on axonal injury in neonatal HI damage and molecular mechanisms to find new ideas and new approach targets on prevention and treatment of newborn HI injury.

Iduna是一种重要的促生存泛素连接酶，对脑卒中神经元损伤具有保护作用。我们发现：缺氧缺血（HI）引起新生大鼠脑轴突损伤的同时存在内源性Iduna下调的现象；在离体神经元中下调Iduna会降低轴突标志物的表达。然而，Iduna在HI新生鼠轴突损伤中的作用及机制尚不清楚。Wnt通路是神经元轴突发育和分化的重要调节通路。我们发现HI鼠脑组织中Wnt通路的负性调控蛋白Axin显著增多。研究显示，乳腺癌细胞中Iduna能够促进Axin的泛素化降解。那么HI 新生鼠大脑神经元轴突损伤是否与Iduna下调引起Axin堆积抑制Wnt通路有关？机制如何？本项目拟在前期研究基础上，综合运用基因克隆、病毒包装、RNAi、qPCR、Western-blot及CLSM等技术，通过体内和体外实验，探索Iduna调控Wnt信号在HI新生鼠大脑神经元轴突损伤中的作用及分子机制，为新生HI脑损伤的防治提供新思路和新靶点。

缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)性脑病是因脑组织氧供部分或完全不足、脑血流量减少或暂停引起的一种脑损伤,是新生儿早期死亡及后期神经功能障碍的主要原因之一。Iduna 是一种重要的内源性促生存泛素连接酶，在脑缺血后发挥神经保护作用。有研究表明HI后期的脑瘫、癫痫、行为和学习障碍可能与神经元轴突功能异常有关，但缺氧缺血对神经元轴突生长的影响及Iduna与轴突生长发育的关系还有待证实。本项目通过体内体外实验，探讨Iduna在HI脑轴突损伤中的作用。结果首先证实 HI 脑损伤会引起新生大鼠海马神经元数量减少、轴突断裂、轴突蛋白含量明显降低，且轴突损伤与 Iduna 蛋白量的变化有关。然后构建过表达 Iduna 腺病毒并成功上调神经元中 Iduna 含量，通过离体实验对比观察发现，过表达 Iduna 可有效减轻缺氧神经元轴突损伤，并提高神经细胞存活率。我们检测了Axin及Wnt 通路的相关分子，结果显示低浓度氯化钴诱导细胞化学缺氧，会引起内源性的Iduna、连环蛋白 β-catenin 表达增多，GSK3、APC、轴蛋白 Axin 表达减少。随着氯化钴浓度的增高，内源性的Iduna表达逐渐降低，β-catenin的含量与Iduna呈正相关，GSK3、APC、Axin的表达与Iduna呈负相关。过表达 Iduna ，可以介导 Axin 蛋白的泛素化降解，抑制 Axin/GSK3/APC 复合体的形成，导致胞内 β-catenin 浓度增加，Wnt/Axin通路活化，进而起到神经保护作用。最后，通过复制 HI 脑损伤模型，观察证实上调Iduna可以改善新生鼠长期记忆能力、降低脑梗死体积、使脑组织损伤减轻。提示神经元轴突功能异常是缺氧缺血性脑损伤后行为、学习和认知障碍的原因之一，而Iduna发挥轴突保护作用可能与调控Wnt/Axin通路有关。课题实施期间已发表学术论文5篇，为新生儿缺氧缺血性脑损伤的防治提出了新的见解。