甲状腺激素在黄鳝性腺分化中的功能研究

The mechanism of sex determination, gonadal differentiation and sex reversal is an important subject in the study of fish reproductive development. Rice field eel (Monopterus albus) is a protogynous hermaphroditic fish, which exhibits sex reversal from functional female via intersex into male. This project mainly focuses on the functional study of thyroid-stimulating hormone (TSH), a key regulator factor in the hypothalamic-pituitary-thyroid axis, in gonadal differentiation in rice field eel. Firstly, the full-length cDNA sequence of TSHβ was obtained by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends methods (RACE). The expression analysis of TSHβ in different tissues and developmental stages of sex reversal was carried out by real-time quantitative PCR, in situ hybridization and immunofluorescence methods. The concentration of thyroid hormone (TH) was detected in different stages of gonadal development and sex reversal in rice field eel. Secondly, by using static incubation of gonadal fragments and intraperitoneal injection methods, the present research will demonstrate the effects of TH on sex steroids and the expression of gonadal differentiation-related genes. Lastly, based on the technology of embryonic microinjection and genome editing in rice field eel, we will generate the TSHβ transgenic and mutant fish, which will provide helps to the further research on TH in gonadal differentiation and regulatory mechanisms. This project will not only demonstrate the function and molecular regulatory mechanism of TH in gonadal differentiation and sex reversal, but also stimulate the sustainable development of aquaculture in rice field eel.

性别决定、性腺分化以及性逆转机制研究一直是鱼类生殖发育领域的重要科学问题。本项目以雌雄同体、雌性先熟性逆转鱼类黄鳝为研究对象，探讨下丘脑-垂体-甲状腺轴上的关键信号分子促甲状腺激素（TSH）在黄鳝性腺分化中的功能。首先，在黄鳝中克隆获得TSHβ基因序列，采用荧光定量PCR、原位杂交和免疫荧光方法研究其在黄鳝不同组织及性逆转阶段的表达；同时检测性腺发育不同阶段及性逆转过程中血清甲状腺激素（TH）的含量。其次，采用性腺体外孵育和体内腹腔注射相结合的方法，探明甲状腺激素对黄鳝血清性类固醇激素含量及性腺分化相关因子表达的影响。最后，利用建立的黄鳝胚胎显微注射及基因编辑技术平台，获得TSHβ转基因和基因敲除鱼，深入开展TH在黄鳝性腺分化中的功能及调控机制研究。本项目的研究结果不仅有助于揭示TH在黄鳝性腺分化及性逆转过程中发挥的功能及内在分子机制，而且有助于黄鳝养殖产业的可持续发展。

下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamus-pituitary-thyroid，HPT）轴是一种重要的神经内分泌轴，在鱼类胚胎发育、仔鱼变态和性别分化调控中具有重要作用。本项目以HPT轴上的重要调控因子促甲状腺释放激素（thyroid-releasing hormone，TRH）和促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）为切入点，探讨甲状腺激素（thyroid hormone，TH）在黄鳝性别分化和性腺发育中的功能。本项目克隆获得黄鳝trh基因全长cDNA序列，其主要分布在脑区，在卵巢、精巢、肌肉和垂体中具有中等水平表达。性逆转过程中，trh在性逆转后期的下丘脑中表达量显著增加；而在性逆转不同时期的性腺中，trh表达呈先升高后降低趋势。无论体外孵育还是体内注射，TRH对tshβ基因表达和血清TH含量均无显著影响，表明其可能并不参与HPT轴调控。体外孵育黄鳝卵巢，gsdf基因表达显著上调。腹腔注射TRH促进性腺gsdf基因表达，抑制cyp19a1a基因表达，并增加血清11-KT含量。.本项目也获得黄鳝tshβ基因cDNA序列，其在垂体中表达量最高，其次主要分布在脑区、性腺、肠和肝脏。性逆转不同时期，tshβ在垂体中的表达无显著变化；性腺中的表达表明其在间性后期和精巢中的表达量显著增加，暗示其可能同雄性性腺发育有关。虽然T3注射对血清E2含量无显著影响，但高浓度时显著上调了血清11-KT含量。T3下调了雌性性腺分化相关基因foxl2、cyp19a1a和dax1表达，上调了雄性性腺分化相关基因sox9a1表达。结果表明，TSH可能参与了黄鳝性别分化，而且甲状腺激素可能调节了雄性性腺发育，并在黄鳝性逆转过程中发挥一定功能。.本项目同时开展了不同浓度T3浸泡处理出膜7 d的黄鳝幼苗，共处理60 d，检测其对黄鳝生长，性腺发育，血清TH、E2和11-KT含量，性腺凋亡，以及性腺分化相关基因表达的影响。目前已经获得样品，等待进一步处理和数据分析。采用CRISPR/Cas9技术获得了黄鳝tshβ基因敲除P0代个体，等待进一步传代获得纯合突变体，为深入开展tshβ基因在黄鳝性腺分化中的功能研究提供基础。本项目初步揭示了HPT轴关键因子在黄鳝性腺分化中的功能，丰富了黄鳝性逆转机制研究，同时为深入开展性腺分化调控机制研究奠定了基础。