基于磷酸化蛋白质组学的稻瘟菌激发子诱导水稻抗性的分子机制研究

Rice blast, caused by the fungal pathogen Magnaporthe oryzae, is the most destructive disease of rice. It is very difficult to control the disease because of the frequent appearance of new races of M. oryzae. The glycoprotein elicitor CSBI from M. oryzae, an important signal molecule, has been shown to mimic a pathogen invasion and induce rice defenses against M. oryzae. However, much still remains unclear about the defense signal transduction in rice induced by the elicitor. Protein phosphorylation, as a rapid, reversible post-translational modification, plays a key role in singal recognition, signal transduction and defense responses between plant-pathogen interaction. To explore the molecular mechanisms involved in elicitor-induced rice defense, we will analyze the changes of plasma membrane phosphoproteome and cellular phosphoproteome on resistant cultivar (cv. C101LAC) and susceptible cultivar (cv. CO39) at various time points after CSBI elicitor treatment by using isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)-based comparative phosphoproteomic approach. We will also conduct the prediction of phosphoprotein function and the analysis of their biological function by bioinformatics and gene over-expression techinique. This study will provide new insights into the regulatory mechanisms for elicitor-dependent signal transduction pathways and discover complex protein networks involved in rice defense response regulated by the elicitor. It is the first attempt to measure rice phosphoproteomic changes induced by M. oryzae elicitor, which will provides a better view of elicitor-induced rice defense responses.

稻瘟病是水稻最主要的病害之一，其防治一直是研究的重点。稻瘟菌激发子作为一种重要的信号分子和潜在的作物保护剂，可诱导水稻的抗瘟性，但目前对于其诱导水稻抗性的信号转导等分子机理仍不清楚。蛋白质磷酸化作为植物信号转导和酶活性调控的核心，已被证实在植物与病原菌互作的信号识别、信号转导和抗性反应中起着关键作用。为了更好地了解激发子诱导水稻抗性的分子机理，本研究以水稻抗稻瘟病近等基因系为材料，通过基于iTRAQ的磷酸化蛋白质组学技术，分析激发子诱导的水稻叶片细胞质膜及胞内蛋白质的磷酸化修饰状态及其变化，并结合生物信息学和基因过表达等技术对磷酸化蛋白质进行功能预测及生物学功能分析，为揭示激发子介导的水稻抗性信号识别和信号转导等分子机理提供理论依据，有助于从整体水平了解激发子诱导水稻抗瘟性调控的生物学网络。本项目也是首次从蛋白质磷酸化整体水平对稻瘟菌激发子与水稻互作的信号通路分析，具有较好的创新性。

稻瘟菌激发子作为一种重要的信号分子和潜在的作物保护剂，可诱导水稻的抗瘟性，但目前对于其诱导水稻抗性的分子机理仍不清楚。蛋白质磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，已被证实在植物与病原菌互作的抗性反应中起着关键作用。本项目以抗稻瘟病近等基因系水稻C101LAC及CO39为材料，用激发子处理水稻后不同时间取样（8h、12h和24h），采用基于iTRAQ的磷酸化蛋白质组学技术，对激发子诱导的水稻叶片细胞质膜蛋白质及胞内蛋白质的磷酸化变化进行了分析，分别鉴定了71个差异表达的质膜磷酸化蛋白质和169个胞内磷酸化蛋白质。经生物信息学分析，按照蛋白质功能将71个质膜磷酸化蛋白分为4类，169个胞内磷酸化蛋白分为14类。采用NanoLC-MS/MS技术，鉴定了701条质膜磷酸化蛋白的磷酸化肽段，分属326个磷酸化蛋白和726个磷酸化位点；鉴定了1365条胞内磷酸化蛋白的磷酸化肽段，分属870个磷酸化蛋白和1522个磷酸化位点。采用酶活性测定，验证了6个磷酸化蛋白的活性受到其磷酸化的调控。采用qRT-PCR技术，对25个磷酸化蛋白进行了转录水平的验证分析，发现其蛋白质水平变化与mRNA水平变化缺乏相关性。应用转基因技术，对磷酸化蛋白PP2C和WRKY11在水稻中进行了超表达分析，发现这2个蛋白基因均与水稻的抗瘟性相关。综上，该激发子诱导水稻抗性的工作模式是，激发子诱导水稻质膜H+-ATPase和受体类蛋白的磷酸化变化进行信号识别，下调胞内活性氧清除酶系的磷酸化水平，促进H2O2快速积累；H2O2作为上游信号分子刺激胞内信号转导相关蛋白的磷酸化和脱磷酸化，激活胞内的多条抗性信号通路（如Rac GTPases介导的信号通路等），从而诱导水稻防卫反应的发生。本项目是首次从蛋白质磷酸化整体水平对稻瘟菌激发子与水稻互作的信号通路分析，有助于从整体水平了解激发子诱导水稻抗瘟性调控的生物学网络。