细胞外基质蛋白him2/fbln8与心脏心肌心血管发育构建的遗传机理研究

The extracellular matrix protein (ECM) hemicentin2 or fibulin8 (hem2/fbln8) is the highly conserved protein with high identity with another Hemicentin family member hem1/fbln6. Its function study of this gene is largely unknown. Our data indicate that hem2/fbln8 protein situates in intercalated disk between cardiomyocyte cells along cardiac myofibril structure as distribution of hemicentin member hem1/fbln6, and meanwhile hem2/fbln8 protein distributes in middle- and small-size vessels in adult heart. Our study revealed that haploinsufficiency can lead to server cardiac defect on the conventional mutants in both hem1/fbln6 and hem2/fbln8 model mice. Furthermore, our preliminary data elucidate that hem2/fbln8 contributes in earlier development of blastocytic while hem1/fbln6 functioning pre-implantation by targeting on mitotic symmetric division. In this proposal, we intend to investigate the function of ECM hem2/fbln8 during early development and heart development tube, two-chamber heart to four-chamber heart using our newly generated conditional knockout mice by crossing with cardiomyocyte and/or vascular specific Cre transgenic mouse. Promotion with exercise and pressure overload treatments, we propose to investigate hem2/fbln8 function in adult model animal as well to furthermore explore its critical role initiated from development. Our study will provide valuable information for comprehending molecular pathological mechanism on human heart developing disorder and other cardiac diseases.

细胞外基质蛋白Hemicentin家族hem2/fbln8是一个高度进化保守的蛋白。我们的数据表明该蛋白与其仅有的家族成员hem1/fbln6一样在心脏心肌细胞闰盘分布，并且还分布于心脏中小型血管中；经典敲除方法获得的该突变小鼠研究显示存在基因半量效应，表现出心脏功能的缺陷。另外我们的实验还显示，hem2/fbln8蛋白分布于囊胚期初级分化细胞上，预示它与hem1/fbln6相似且很可能造成细胞有丝分裂之胞质分裂的失败导致细胞多核的现象。因而，本申请中我们拟以近两年制得的hem2/fbln8基因条件敲除小鼠为材料，在心脏心肌细胞和血管内皮细胞中特异性敲除该基因以探索细胞外基质蛋白hem2/fbln8在心脏从管心到二腔心到四腔心的发育分化和细胞组织构建形成中的重要作用；并进行心脏压力超负荷处理、剧烈运动和激烈情绪波动等实验揭示该基因作用于心脏发育构建过程进而影响成体心脏生理功能的机理。

胞外基质蛋白EHF2/8是一个具高度进化保守性的编码蛋白，连同它的orthologue胞外基质蛋白EHF1/6一道，目前发现它们主要分布于起源于外胚、中胚层和内胚层的各类组织与器官中，特别是在内上皮及外上皮细胞和血管组织中，分布非常广泛功能相当重要，由于高度进化保守性，该蛋白甚至可能为鉴别痕迹物质的重要指标。EHF2/8与其相关的EHF1/6和调节蛋白CAMA在在心脑血管中的功能以及分布特别是心脏中分布特征广受同行的关注。基于我们首次报道该蛋白基因缺失会导致细胞有丝分裂之胞质分裂的失败以致细胞多核现象并得到国际同行关注的结果，本课题使用经典敲除方法，规避了极具争议的CRISPR编辑脱靶的重要缺陷，获得了本土本实验室具有知识产权的EHF2/8和EHF1/6基因修饰突变小鼠以及CAMA的转基因小鼠，并以这些模式小鼠配合TAC/Coronary ligation等经典方法和现在获得了重要同行推崇的RNAseq等获得主要研究结果概述如下：（1）使用具有本土知识产权的hem2/fbln8基因突变模式小鼠，我们在发现EHF2/8小鼠具有年龄相关的心血管功能异常的情况下，以非开胸低创对动脉弓进行结扎揭示了EHF2/8突变鼠表现出深度的房室阻断，出现二级房室阻断和三级阻断P波独立（P-wave independency）的现象。（2）引入的膳食干预条件，EHF2/8调节蛋白CAMA转基因小鼠模型得到高蛋白高脂膳食结构并不一定导致肥胖症的可能遗传决定因素。（3）RNAseq分析表明进化高度保守的EHF2/8基因EHF2/8基因表达调控在诸如胶原蛋白、CICR相关的其他确证途径（如RyR和IP3R）等已知途径的链接中意义重大，EHF2/8基因密切相关的心功能的未知代谢途径将为揭示EHF2/8相关的独特研究方向和课题提供有价值的新视角。（4）RNAseq分析表明EHF2/8基因涉及的功能极其广泛，除在心脏中起作用，在分子功能MF上 mRNA结合和蛋白丝色氨基酸激酶、转录共抑制活性和转录共抑制活性、mRNA 5'端域结合活性和polyA结合活性等同步差异聚类具明显统计学意义。（5）我们还偶然的发现EHF2/8和EHF1/6基因与卵子成熟和卵子外排直接相关，EHF2/8对促进排卵的激素更具敏感性而EHF1/6更具广泛性。