可逆性人源性永生化肝细胞系的构建及其在生物型人工肝中的应用

针对困扰生物型人工肝临床应用的肝细胞来源、培养、冻存及生物反应器等关键性问题，本课题拟应用编码SV40LTag基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因插入loxP重组位点中，构建重组表达载体，并电转染至正常人肝细胞，建立可逆性人源性永生化肝细胞系；应用转瓶培养系统培养永生化肝细胞系，优化培养基配方，建立永生化肝细胞体外大规模培养方法；应用程控降温技术，筛选不同的冻存液配方，建立永生化肝细胞大量冻存的方法；应用表达Cre重组酶的重组腺病毒载体转染至永生化的肝细胞，以切除loxP序列中SV40LTag基因，使肝细胞回复到永生化前的原代细胞状态，旨在得到安全、有效的肝细胞；应用新型膜材料构建生物反应器，接种回复后的永生化肝细胞，构建新型生物型人工肝系统，通过猪急性肝衰竭模型对人工肝系统进行安全性和疗效评价，最终获得安全、高效的具有自主知识产权的生物型人工肝系统。