希瓦氏菌群体感应信号分子特异性结合蛋白的结构及功能研究

A freshwater bacterial strain, Shewanella sp. LZH-2, with strong algicidal properties against harmful cyanobacteria was isolated , which expressed obvious quorum sensing . However, there is no research about the quorum sensing autoinducers and its specific binding protein of algicidal bacteria. In this study, quorum sensing autoinducers and its specific binding protein’s structure and function of Shewanella sp. LZH-2 will be revealed. The strategy is as follows: (1) Based on a thin-layer chromatography biosensor assay and LC-MS/MS , quorum sensing autoinducers of Shewanella sp. LZH-2 was identified; (2) specific binding protein was severed by affinity chromatography, and then its structure was determined by cryo electron microscopy; (3) its function was confirmed by molecular bio-techniques. This subject will reveal the quorum sensing mechanism of algicidal bacteria Shewanella sp. LZH-2, and provide theoretical basis for controlling the water blooms, which has a certain theoretical significance and application value.

希瓦氏菌LZH-2是一株高效溶藻菌，我们研究发现其表现出群体感应。但迄今还没有关于溶藻菌群体感应信号分子，以及信号分子与特异性结合蛋白相互作用的报道。本申请课题针对溶藻菌群体感应的问题，拟开展希瓦氏菌LZH-2群体感应信号分子及其特异性结合蛋白的结构、功能研究，具体研究内容包括：(1)首先对溶藻菌希瓦氏菌LZH-2中的群体感应信号分子进行鉴定；(2)然后利用信号分子亲和层析实验筛选出群体感应信号分子特异性结合蛋白，使用冷冻电镜对信号分子-结合蛋白复合物进行结构解析；(3)最后采用分子生物学手段，分析特异性结合蛋白在溶藻菌群体感应和溶藻活性中的功能。本申请项目首次从溶藻菌群体感应信号分子及其特异性结合蛋白层面阐述溶藻菌希瓦氏菌LZH-2群体感应机理，为蓝藻生物防治提供理论依据，具有一定的理论意义和应用价值。

由于农业集约化和工业污染，我国湖泊水质不断下降，处于严重富营养化状态，爆发了严重的蓝藻水华。研究人员发现溶藻细菌能够导致蓝藻水华的消退，因此溶藻细菌具有控制蓝藻水华的巨大潜力。希瓦氏菌Lzh-2是一株高效溶藻菌，我们研究发现其表现出群体感应，但迄今还没有关于希瓦氏菌溶藻群体感应机理的研究。通过高通量测序技术我们获得了Lzh-2的完整基因组，根据基因组分析，Lzh-2中存在LuxS/AI-2群体感应系统中的关键基因LuxS。为研究LuxS基因对溶藻特性的影响，构建LuxS敲除质粒，筛选出LuxS完全敲除的克隆；构建LuxS表达质粒，通过结合转化，将表达质粒重新整合到LuxS敲除菌株中，构建成回补菌株。通过将蓝藻与不同菌株进行共培养发现，野生型Lzh-2具有杀死蓝藻的溶菌活性，并且具有群体感应现象，LuxS敲除菌株则不具有溶藻活性，LuxS回补菌株再次显现出溶藻功能，并具有群体感应效应。进一步分析溶藻活性物质发现，野生型和回补菌株可以分泌溶藻物质, 其分泌行为具有群体感应特征。而LuxS敲除菌株即使在高浓度细菌下也无法产生溶藻物质。结合基因组序列分析，活性物质检验，基因工程手段和共培养体系证明Lzh-2通过LuxS/AI-2群体感应系统调控溶藻活性。同时我们对溶藻菌希瓦氏菌LZH-2中的群体感应信号分子进行鉴定，然后利用信号分子亲和层析实验筛选出群体感应信号分子特异性结合蛋白，并进行结构解析，相关工作还在进行当中。此外在基金资助下我们开展了溶藻菌筛选鉴定及其溶藻机理的研究，筛选到门多萨假单胞菌LZH-B1并从代谢产物、生理生化和功能基因等层面分析其溶藻机理。本项目研究希瓦氏菌溶藻群体感应机理，为蓝藻生物防治提供理论依据，具有一定的理论意义和应用价值。