肽聚糖识别蛋白（PGRPs）介导小菜蛾免疫的机理研究

昆虫免疫系统的的激活受Toll/Imd信号通路的调控，而肽聚糖识别蛋白（PGRPs）是开启Toll/Imd信号通路的关键模式识别蛋白。本项目拟以小菜蛾为实验材料，运用SSH文库和RACE技术克隆小菜蛾体内的PGRPs基因，运用RNAi技术阻断小菜蛾PGRPs基因的表达，从而使启动小菜蛾免疫系统的Toll/Imd信号传导途径阻断或减弱，使小菜蛾更易感病而死亡，以期为通过调控害虫的免疫系统的开启来控制害虫奠定基础。运用定量RT-PCR、Northern印迹等方法检测PGRPs阻断前后抗菌肽基因的表达谱，阐明PGRPs在小菜蛾抗菌肽信号传导中的功能；采用SSH文库筛选免疫的健康小菜蛾和RNAi抑制小菜蛾虫体的抗菌肽cDNA序列，以期获得小菜蛾体内新的抗菌肽基因。该项目运用了靶标特异性强的RNAi技术，避免了环境污染，为小菜蛾的综合防治提供了一种新的手段，并为新的抗菌肽基因的筛选开辟新的思路。

1、.为了更好的挖掘小菜蛾体内的免疫基因相关基因，本实验测定了小菜蛾的转录组，并结合本实验室构建的SSH文库，综合筛选到的725条免疫相关Unigenes中，其中共获得了8个PGRP的Unigenes。本研究利用RACE技术克隆得到5个PGRP的cDNA全长，包括4个S型和一个L型，分别命名为：PxPGRP-SA (EU399240)，PxPGRP-SB， PxPGRP-SD, PxPGRP-S2和PxPGRP-LC。.2、.为了更好探讨小菜蛾PxPGRP的结构和功能。在原核细胞中表达了PxPGRP-SA，并制备了多克隆抗血清。免疫组化检测表明PxPGRP的主要表达部位是其脂肪体。为了研究其功能，在SF9 细胞和果蝇S2细胞中表达了PxPGRP-SA，利用His-taq一步纯化了重组的PxPGRP-SA。粘附实验表明细胞重组的PxPGRP-SA对格兰氏阳性菌具有较强的粘附结合功能，预示PxPGRP-SA对革兰氏阳性菌具有重要的识别反应。.3、.利用制备的PxPGRP-SA蛋白和抗PxPGRP-SA血清分别注射小菜蛾，结果表明在注射PxPGRP-SA蛋白的血淋巴中的PPO活性明显高于注射抗PxPGRP-SA血清的PPO活性；同时注射PxPGRP-SA蛋白的血淋巴中的细菌的存活率明显低于注射抗PxPGRP-SA血清的血淋巴中的细菌存活率；RNAi阻断了PxPGRP-SA的表达后的血淋巴的PPO活性也有所下降，结果表明PxPGRP-SA在启动PPO活性过程中起着重要作用。.4、.本研究利用RNAi阻断了PxPGRP-SA的表达，荧光定量PRC检测表明，PxPGRP-SA表达沉默后，抗菌肽基因cecropin1，Cecropin2，defensin和Lysozyme1的表达明显降低，而且，RNAi阻断了PxPGRP-SA的表达后的血淋巴中的细菌存活率明显升高。结果表明PxPGRP-SA在小菜蛾抗菌肽表达过程中起调控作用。进一步研究表明，PxPGRP-SA基因的沉默，提高了玫烟色棒束孢对小菜蛾的致病能力。.5、.通过以上研究，挖掘了8个小菜蛾PGRP的Unigenes，克隆了5 个小菜蛾PGRP的全长，明确了PxPGRP-SA在小菜蛾抗菌肽表达和酚氧化酶活性中起着重要功能；发表文章4篇，其中SCI文章一篇；投稿文章（SCI）3篇。