基于蛋白质组芯片的全局性蛋白质去乙酰化酶发现及功能研究

Protein acetylation is one of the most important post-translational modifications (PTMs). It is very abundant and play a variety of key roles in many biological processes. A large amount of acetylated proteins have been identified from E.coli to human, these proteins are essential for energy metabolism, protein synthesis, chromatin organization and etc. Protein acetylation is controlled by protein acetylase and deacetylase. While there are a large number of acetylated proteins have been identified, a limited number of deacetylases are known. For example,in E.coli,there is only one deacetylase, i.e., CobB, and hundreds acetylated proteins.It is unimaginable that a single enzyme could efficiently control the dynamic deacetylation of so many acetylated proteins.Based on literature analysis and our unpublished data, we hypothesize that there are more protein deacetylase to be discovered. As a solid foundation, we have developed a proteome microarray based strategy by the supporing of the previous NSF grant, namely, Clip-chip technology, that is capable of global novel enzyme discovery. To test our hypothesis, we are planning to use the Clip-chip technology, combined with an E.coli proteome microarray that carries 4,256 proteins for de novo protein deacetylase discovery. We will further thoroughly validate at least of the newly discovered novel protein deacetylase and perform functional analysis on this enzyme.

蛋白质乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式，在生物体中广泛存在并具有重要的生物学功能。目前已经从包括原核的大肠杆菌到人细胞中发现了大量的乙酰化蛋白质，这些蛋白质涉及到了包括能量代谢，蛋白质合成及染色质组装等在内的一系列重要的生物学过程。蛋白质的乙酰化由蛋白质乙酰转移酶和蛋白质去乙酰化酶共同控制。目前已知的蛋白质去乙酰化酶数量有限，如在大肠杆菌中仅有一种（CobB），与之对应的则是几百种大肠杆菌乙酰化蛋白质。很难想象单一一种酶是如何有效地应对如此众多蛋白质的去乙酰化。因此，基于文献分析及前期实验结果，我们推测有的新的蛋白质去乙酰化酶存在。为了证实这一推测，我们拟采用前期研究中所建立的基于蛋白质组芯片的全局性新酶发现技术（Clip-chip技术）结合大肠杆菌蛋白质组芯片来进行新蛋白质去乙酰化酶的发现，并在此基础上对新发现的去乙酰化酶进行系统验证和功能研究。

蛋白质是由基因所编码，蛋白质在其生命周期内往往会被打上不同类型的修饰，而且这些修饰往往也是动态变化的。蛋白质翻译后修饰会以极其精细的方式影响和调控蛋白质的功能。乙酰化作为一种重要且广泛存在的蛋白质翻译后修饰类型，与一系列重要疾病密切相关，影响众多关键的生物学过程。随着蛋白质组技术的进步，目前已经从低等的大肠杆菌到高等的人等众多生物的细胞中发现了成千上万的乙酰化修饰。蛋白质的乙酰化由乙酰转移酶和去乙酰化酶所调控。对应海量的蛋白质乙酰化修饰，目前已知的乙酰化酶和去乙酰化酶数目非常有限，仍有相当数目的新酶有待发现，一个关键问题是“如何实现高效乙酰化相关酶的发现？”。针对这一问题，我们发展了一套称之为“Clip-chip”的技术，在大肠杆菌蛋白质组芯片的基础上，进行了全局性蛋白质去乙酰化酶的发现，发现了一种新的去乙酰化酶YcgC。该酶能够非常高效地去除底物蛋白RutR赖氨酸52位和赖氨酸62位的乙酰化。已知的蛋白质去乙酰化酶的活性依赖于NAD+或者Zn2+，但YcgC的去乙酰化活性并不依赖于以上两者。进一步的功能实验表明，YcgC通过去乙酰化影响RutR的转录调控活性。我们比较了YcgC与大肠杆菌中唯一的去乙酰化酶CobB对大肠杆菌表达谱的影响，结果表明，两者既有相似点，也有较大的不同，提示YcgC的底物谱与CobB的可能有较大的不同。通过全基因合成，作者获得了来源于多个其它细菌的大肠杆菌YcgC的同源基因克隆，表达测试表明这些克隆所表达的蛋白均具有蛋白质去乙酰化酶活性。本研究所发现的YcgC可能代表一个全新的蛋白质去乙酰化酶家族。同时本研究中所发展的Clip-Chip技术具有通用性，可方便地移植于其它酶的发现中。