小RNA SbfR调节伤寒沙门菌生物膜形成的机制

SbfR is a 138-nt novel small RNA recently found by us with RNA-seq analysis, which is located between the gene yegD and the coding region of the hypothetical protein St0898 in Salmonella enterica serovar Typhi. Previous research showed that after overexpression of the SbfR with a recombinant plasmid, the biofilm formation of S. enterica serovar Typhiwas was obviously increased. To clarify the mechanism of the SbfR regulating the biofilm formation of Salmonella, in this program we want to analyze the characteristic of SbfR expression with qRT-PCR and northern blot and investigate effect of biofilm formation regulators on the expression of SbfR in S. enterica serovar Typhi. Selection of the putative target gene of the SbfR will be performed according to the results of genomic transcriptome assay, MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing analysis and bioinformatic predicted scanning. The molecular interaction of the SbfR with candidate target genes associating with biofilm formation will be confirmed with molecular biological methods, such as construction of point mutation of target gene and overexpression of SbfR in S. enterica serovar Typhi. The pass way of SbfR regulating the gene expression associated Salmonella biofilm formation will be analyzed also. It is very possible that results of the research will highlight the knowledge of the gene expressional regulation network involved in biofilm formation of Salmonella.

SbfR是本研究组最近利用RNA-seq技术在伤寒沙门菌中发现的一个新的小RNA，长为138个核苷酸，初步研究发现，sRNA高表达能促进伤寒沙门菌的生物膜形成。本项目拟围绕伤寒沙门菌SbfR的表达和作用，用qRT-PCR和northern blot，分析SbfR的表达特性，并利用基因突变和高表达技术，分析与生物膜形成相关的各种调节因子对SbfR表达调节作用；通过全基因组表达谱分析，MS2亲和层析及RNA测序分析，结合生物信息学分析，选取SbfR靶基因，进而利用SbfR高表达及靶mRNA配对碱基点突变等策略，验证SbfR对其靶基因表达调节作用，分析SbfR参与沙门菌生物膜形成调节的路径，以揭示SbfR参与细菌生物膜形成调节的作用机制。研究将有助于深入了解沙门菌生物膜形成的网络调节机制。

细菌生物膜形成与药物耐受密切相关，相关基因表达调节呈网络化特性。项目系统分析了伤寒沙门菌小RNA SbfR和其它非编码RNA在细菌生物膜形成过程中的调节作用机制，发现SbfR全长为138bp，始于yegD的ORF终止码下游63bp，在对数生长中、晚期和稳态期高渗应激下的表达较高，而氧应激下的表达明显下降，转录表达谱分析发现，有一系列与细菌生物膜生成相关基因的表达有差异，包括鞭毛、菌毛等相关基因受SbfR调节，部分已知和未知功能的非编码RNA表达也有差异，可能参与细菌生物膜形成调节网络。进一步研究还发现，SbfR对伤寒沙门菌的生物膜形成有双向调节作用，SbfR能促进伤寒沙门菌FljB:z66蛋白表达，SbfR的前后各69 nt两部分都有可能对有关靶基因的表达发挥作用。 研究也发现伤寒沙门菌膜蛋白SurA受RcsCDB系统调节，通过调节FljB表达发挥其对细菌生物膜形成调节作用。研究明确RibE的3’-UTR（RibS）对伤寒沙门菌生物膜形成影响作用机制，能通过cfa和其他未知的靶基因来促进伤寒沙门菌的生物膜形成。研究表明ncRNA 305对伤寒沙门菌生物膜形成影响作用机制，发现其全长495 nt，能通过直接结合或间接作用促使fljB mRNA发生降解，从而影响fljB表达和生物膜形成。研究也发现反义RNA（AsfD）全长约2100bp，覆盖flhDC全部和部分motA基因，其在细菌生长稳态期表达较高，受OmpR、Fis的正调控和RpoS的负调控，能通过促进flhDC基因表达，进而增加细菌生物膜的形成。此外，研究还发现，DNA结合蛋白Fis对细菌持留所必需，能通过调节谷氨酸转运和代谢调节细菌持留。研究还建立了有关miRNA前分类的核苷酸水平卷积神经网络的生物信息学分析方法，有助于对非编码RNA作用分析。研究也支持了关于伤寒沙门菌在巨噬细胞内生相关的机制文献综述。. 项目尤其是在ncRNA对细菌鞭毛基因表达调节和生物膜形成调节机制方面有重要的发现，认为细菌鞭毛基因表达调节在细菌生物膜形成过程中起到核心作用，其表达调节为网络化机制，为非编码RNA和调节因子作用的靶点，对今后抗菌相关研究具有重要的指导意义。