Ghrelin活性片段及其类似物的血-脑屏障透过性和镇痛作用研究

Currently, it's an important work to look for endogenous analgesics of good ability to cross blood brain barrier, stability of enzymatic degradation and long analgesic effect. Ghrelin, a endogenous braingut peptide was discovered in recent decade which can cross blood brain barrier. Ghrelin has good antinociception. It's utilization was inhibited by it's instability and difficulty of synthesis. Firstly, this topic is to synthesize active fragments of ghrelin using solid-phase peptide synthesis and identify these active fragments; then, the ability to cross blood barrier of these compounds will be measured using RP-HPLC and ELISA. The the acute pain modulation of these compounds will be measured using the tail withdrawal test and hot-plate test in mice, and the stability of enzymatic degradation will be measured using RP-HPLC. Secondly, the good fragments of ghrelin will be choosed as templates to synthesize analogues. Then，these fragments will reform through inserting (-CH2-NH-) and unnatural amino acids to improve their stability. The good analogues will be choosed using the experiments above. At last, it will be researched that the receptor pathway of these active fragments of ghrelin and analogues to acute pain throug co-injection of the antagonists of GHSR-1α and opioid receptors. More foundation of searching ideal analgesics will be provided through these researches.

寻找血-脑屏障透过性好，酶解稳定性高和镇痛作用持久的内源性镇痛物质是当前疼痛药物研究的重要任务之一。Ghrelin是近十年来发现的具有血-脑屏障通透性和良好镇痛作用的内源性脑肠肽，但合成困难和易降解特性限制了它的应用。本项目拟首先对ghrelin的各种活性片段进行固相多肽合成，鉴定；然后通过RP-HPLC以及酶联免疫法测定血-脑屏障透过性，用小鼠甩尾实验和热板实验测定其镇痛活性，并测定其酶降解稳定性。其次，选用有良好特性的活性片段，通过假肽键(-CH2-NH-)和非天然氨基酸的引入进行结构改造，合成ghrelin活性片段的类似物以提高其酶降解稳定性，并通过以上实验项目进行筛选。最后，对筛选出的理想分子片段，采用共注射GHSR-1α拮抗剂以及各种阿片受体拮抗剂的方法，进行镇痛活性受体机制研究。通过以上研究，将为进一步研究开发理想的镇痛药物打下基础。

寻求有效防治疼痛的药物和方法仍是当前医药界的重要任务。传统的镇痛药物因成瘾性、呼吸抑制等不良反应和副作用使之不能成为理想的镇痛药物，因此，针对内源性物质的研究得到了高度关注，但很多内源性镇痛物质不能透过血-脑屏障。Ghrelin是近十年来发现的具有血-脑屏障通透性和良好镇痛作用的内源性脑肠肽，但其合成困难、价格昂贵和半衰期短等特性极大地限制了ghrelin的临床应用。Ghrelin活性片段及受体激动剂具有结构简单，易合成的特点。本项目首先对ghrelin的各种活性片段进行固相多肽合成，鉴定；其中合成了ghrelin(1-7)-NH2, ghrelin(1-7)-Lys-NH2, ghrelin(1-11)-COOH, GHRP-2, GHRP-6等5个ghrelin活性片段以及受体激动剂，并通过质谱以及HPLC等检测方法鉴定。其次，通过侧脑室注射以及甩尾实验，检测了以上ghrelin活性片段以及受体激动剂的镇痛活性，结果显示以上ghrelin活性片段以及受体激动剂能对小鼠产生时间和浓度依赖性的镇痛作用，最佳镇痛时间点出现在药物注射后的5min或10min，之后作用随时间逐渐降低，于50-60min后消失。再次，通过镇痛机制研究发现，以上ghrelin活性片段以及受体激动剂主要通过激活GHS-R1α和阿片受体系统产生镇痛作用。其中，ghrelin和ghrelin(1-7)-NH2诱导的镇痛机制进一步通过qRT-PCR以及Western blot等方法研究，结果显示ghrelin和ghrelin(1-7)-NH2是通过先激活GHS-R1α，然后上调δ阿片受体内源性配体PENK和其受体OPRD的表达，进而二者结合来产生镇痛效应的。通过以上实验，有望能为开发镇痛效果好，结构简单，副作用少的高效镇痛剂提供参考。