外小体在HIV-1潜伏激活过程中的作用及分子机制研究

HIV-1 antiretroviral therapy is unable to thoroughly eradicate HIV-1 infection in the body. Understanding of the mechanisms of the activation of latent HIV-1 is the essential step for the functional cure of HIV/AIDS. Previous studies by others have shown that exosomes secreted from HIV-1-infected cells can activate latent HIV-1 through viral Tat protein. However, the mechanisms involved are still unclear. This proposal will construct a pseudovirus that contains elements of Tat activation pathway and use the pseudovirus to infect Jurkat T cells, to obtain a latent HIV-1 infection model. The exosomes from HIV-1-infected or uninfected cells will be collected, purified and the added to the latent HIV-1 infection model. The activation of latent HIV-1 will be compared between exosomes from HIV-1-infected or uninfected cells through observation of fluorescence intensity in the model. The miRNAs，proteins and peptides in the exosomes will also be isolated and applied to miRNA RT array , cytokine/chemokine detection chips and mass spectrometry respectively to compare qualitative and quantitative changes of miRNAs, cytokines/chemokines and peptides between exosomes from HIV-1-infected or uninfected cells. Finally, functional confirmation experiments will be carried out to reveal the key miRNAs, cytokines, chemokines and peptides that play an important role in activation of HIV-1 latency. The results of this research are expected to partly reveal molecular mechanisms involved in exosome activation of latent HIV-1 and may provide new clue for the eradication of latent HIV-1 reservoirs.

抗病毒治疗无法彻底清除体内的HIV-1感染，了解潜伏HIV-1的激活机制是功能性治愈的关键。前人已发现HIV-1感染细胞分泌的外小体可通过病毒蛋白Tat激活潜伏病毒复制，但机制未明。本项目通过构建含Tat激活通路元件的假病毒侵染Jurkat T细胞，建立病毒潜伏模型，以感染和未感染HIV-1细胞分泌的外小体做为作用因子，加入到病毒潜伏模型，根据荧光指标比较潜伏病毒激活的情况；采集细胞分泌的外小体，提取其中的miRNA、蛋白和多肽，采用miRNAs阵列分析、细胞因子和趋化因子检测芯片、生物质谱等手段，比较感染和非感染状态下外小体中miRNAs、细胞因子、趋化因子和多肽片段的定性和定量变化；通过功能确证，揭示外小体激活病毒潜伏的关键miRNAs、细胞因子和趋化因子。本项目可望阐明外小体对HIV-1潜伏激活的部分机制，研究结果可为清除病毒潜伏库提供新线索。

外小体是细胞间信息交流的重要组成部分，其中的蛋白质、miRNA以及其它小分子在细胞的生命活动中具有重要作用。本研究的科学假说为HIV-1潜伏激活病人的血清外小体中含有可以激活病毒的成分。基于此，我们希望通过了解外小体中miRNA和蛋白质的成分来深入分析外小体是如何参与病毒激活的机制。为了简化分析和验证方法，本研究采用带有可反映Tat与LTR表达状态的带有荧光报导基团的潜伏细胞感染模型。收集了HIV-1感染治疗AIDS患者和HIV-1感染未治疗AIDS患者血清样本各30例，分别配对同样感染HIV-1病毒但未出现病毒激活的患者各30例共120例病人血清进行研究。外小体与模型细胞共培养实验可观察到来自激活病人的外小体显著增强荧光亮度。提取了每个样本的外小体进行潜伏激活分析。采用iTRAQ标记的蛋白组学技术获取用于四组比较研究的蛋白名称，采用二代测序技术获取用于研究的miRNA序列名称。蛋白信息与miRNA信息基于GO生物学功能分析、KEGG代谢通路分析以及最终基于miRNA下游调控的靶基因的蛋白相互作用分析得到的整合结果。研究发现激活病毒潜伏的外小体样品中具有重要作用的蛋白质和关键的代谢调节途径，揭示参与潜伏激活的蛋白最主要通过补体通路、自噬调节通路、细胞骨架调节通路和血小板激活通路激活病毒转录，这种调控主要通过miRNA参与细胞核内的转录调控实现对对染色体结构的正负调控和转录因子激活，特别是白介素类免疫因子激活实现。研究揭示外小体中的蛋白质与 miRNA在激活过程中分担不同的角色，蛋白主要涉及细胞行为、免疫应答和炎症反应， miRNA 更倾向调控基因转录，包括转录因子和染色体结构调节。 因此可推断miRNA 在病毒潜伏激活中扮演更重要的角色。最重要发现是miRNA参与包括NF-kappa B信号通路、TGF-beta信号通路，Toll-like信号通路以及mTOR信号通路在内的十九条与 HIV-1功能密切相关的代谢通路调控。由此进一步推测外小体 miRNA 在对 HIV-1 潜伏激活具有决定性作用。综上所述，我们的研究提供了潜伏的HIV-1病毒可以通过某种特殊的脉冲而被激活的细胞学证据和数据支撑，这为HIV-1潜伏激活研究提供了研究的思路和方向。