Doublecortin的动态表达在骨折愈合中的作用与调控机制

Healing of bone fracture is a multifactor, multipath, and multistage repairment of the body.Currently,there have no efficient and defferential methods been accepted to promote bone healing.The "Brain-Bone-Blood" triangle consist of nervous system, skeletal system and hemopoietic system plays important role during the process of bone healing.The doublecortin (DCX) gene was originally found in immature neurons. Our previous study firstly found that Dcx was expressed in the mesenchymal cells in the mouse embryonic limb buds, and involved in the development of bone anlagen and cartilaginous anlagen. Expression of DCX closely related with the destiny of chondrocytes. It has been reported that the healing of bone fracture resembles the development of bone anlagen, moreover, our preparatory research firstly found that there did have DCX expressed in the mouse fracture site. Therefore, we presume DCX involves in the bone healing, and the dynamic expression of DCX promotes homing of stem cells and endochondral chondrogenesis, the bioactivity of DCX is regulated by the dephosphorylation from PP1. In present study, we will use the morphological and molecular biological techniques to reveal the relations between DCX and the morphological changes in the fracture sites, and demonstrate the effect of DCX on the BMSCs differentiation to chondrocytes and osteoblasts, and the regulation mechanism of PP1 on DCX. By the animal experiment, the effect of DCX on bone healing and the optimal time and method to interfere by PP1 would be revealed. This study is supposed to find out a new idea to promote bone healing.

骨折愈合是一个多因素、多途径、多阶段的修复过程，目前尚无一种高效、特异的促进骨折愈合的方法被公认。神经、骨骼、造血系统构成的"Brain-Bone-Blood"三角在骨折愈合过程中发挥着重要的作用，课题组在前期工作中首次将发现于神经系统的Doublecortin（DCX）应用于骨发生的研究，证实了DCX在肢芽间充质细胞中有表达，并参与了骨发生与软骨内成骨，其表达量的动态变化与软骨细胞进一步的分化方向密切相关。由于骨折愈合与骨发生的过程相似，并且我们在预实验中也证实了小鼠骨折端存在DCX的表达，因此我们推测DCX参与骨折修复，其在不同时期的动态表达促进了早期干细胞的召集及软骨内成骨。本研究拟检测DCX在骨折端的表达特点，与骨折端的组织形态改变作对比研究，并明确DCX对BMSCs向软骨细胞分化、软骨细胞成骨分化的影响，以及PP1去磷酸化对DCX的调控作用。可望为促进骨折愈合提供一个新思路。

过去的研究证实了DCX表达在小鼠胚胎早期肢芽的间充质细胞中，在骨生发中心和关节软骨中均有表达。软骨内成骨是骨折愈合的重要方式，与胚胎骨生发中心成骨过程相似。本项目拟于去发现DCX的动态表达参与骨折早期的愈合过程，并研究DCX与其它基因的相互影响等。.首先，建立LacZ基因小鼠、DCX-EGFP 转基因小鼠骨折模型，比较骨折后不同时期DCX的表达特点，同时检测Sox9、I型胶原、II型胶原的表达，明确骨折不同时期软骨先驱细胞、成软骨细胞的分化特点。其次，研究与DCX表达相关的基因，对不同孕期的胚胎小鼠掌部骨生发中心作微解剖，分析组织中相关基因的表达量和与DCX及软骨细胞分化的线性关系。再次，应用微阵生物芯片来检测胚胎手掌中不同部位基因表达情况。最后，构建HRST-DCX-GP-eGFP 载体转染脂肪干细胞，经过细胞团培养后检测其中各基因与DCX共表达的特点。.结果发现，大体染色显示DCX参与了骨折后的早期修复，随时间的增加，DCX的分布更加局限于骨折断端。免疫组化显示LacZ、Sox9、Pax7在骨折端有显著的表达，且随骨折后时间的增加，表达有增强；免疫荧光显示：DCX与Pax7无共表达，DCX与Sox9有共表达。说明在骨折断端的愈合过程中，DCX与肌肉先驱细胞无相关性，与软骨先驱细胞相关，与DCX有可能参与骨折端的软骨内成骨的设想一致。通过对胚胎表面荧光检测发现在12.5天孕期时，间充质细胞出现了聚集。微阵生物芯片分析发现62种基因在12.5天小鼠的近端组织中表达量高于在13.5天小鼠腕部表达；有47种基因在在13.5天的小鼠腕部的表达高于12.5天的小鼠近端组织。细胞团培养发现DCX+脂肪干细胞培养出来的软骨块中，CollagenII低表达，Aggrecan， Matrilin 2， GDF5高表达。.研究结果表明，DCX参与了骨折愈合早期的修复过程；我们成功的应用eGFP转基因小鼠中绿色荧光来指导孕期12.5天和13.5天胚胎鼠手掌DCX+部位的微切割；同时，应用微阵生物芯片对于手掌不同部位的相关基因进行筛查，观察到了Cytl1基因的独特表达方式，以及DCX与CollagenII，Aggrecan， Matrilin 2， GDF5等的共同表达特点。这些结果将对骨折愈合中软骨内成骨的过程及DCX生物特性的研究提供基础理论依据。