Caspase-8依赖性细胞凋亡在刺参幼虫变态过程中的作用机制研究

The larval metamorphosis is the key process in the growth and development of marine invertebrates such as sea cucumber Apostichopus japonicus. Caspase dependent apoptosis has been validated to be play important roles in metamorphosis of marine invertebrates, but there are rare studies on the regulation mechanism of development during larvae metamorphosis of A. japonicus. By approaches of molecular biology, cell biology and bioinformatics, this project intends to investigate the molecular structures, expression patterns and functions of Caspase-8 and -3 of A. japonicus at mRNA, protein and cell levels, respectively, and explore the relationship between AjCaspase-8 and -3 during metamorphosis. This program aims to clarify the roles and regulatory mechanism of Caspase-3/8 mediated apoptosis in larvae metamorphosis of this species. The achievements of this project will be very helpful to establish solid theoretical foundation for revealing the mechanism of Caspase dependent apoptosis in larval metamorphosis of sea cucumbers, to enrich and develop the theory of early development of marine invertebrates, and to provide theoretical guidance and new sights on improving production and germination rate of A. japonicus.

幼虫变态是刺参等海洋无脊椎动物生长发育的关键环节。Caspase依赖性细胞凋亡在海洋无脊椎动物变态过程中具有重要作用，但目前关于刺参幼虫变态发育的调控机制研究十分欠缺。本项目以刺参为研究对象，利用分子生物学、细胞生物学及生物信息学等技术，分别从mRNA、蛋白和细胞水平上研究在幼虫早期发育调控中扮演重要角色的Caspase-8和-3蛋白的分子结构、表达模式和功能，探讨其在幼虫变态发育过程中的分工与协作关系，综合分析Caspase-3/8介导的细胞凋亡在刺参幼虫变态发育过程中的作用及其调控机制。研究结果将为阐释Caspase-8依赖性细胞凋亡在棘皮动物海参类幼虫变态过程的作用机制奠定坚实的理论基础，有助于丰富和发展海洋无脊椎动物早期发育理论，为刺参苗种培育和出苗率的提高提供理论指导和新的思路。

变态是实现刺参等许多海洋无脊椎动物习性由浮游转变为底栖的关键阶段。变态过程涉及重大的形态学和生理生化变化，直接影响其种群数量与分布、物种进化以及水产效益。Caspase介导的细胞凋亡在海洋无脊椎动物变态发育过程中具有重要功能，但是其在海参纲幼虫变态过程中的作用机制尚不明确。本课题聚焦Caspase-8依赖性细胞凋亡在刺参幼体变态发育的功能，从细胞、mRNA、组学水平研究了基因结构、表达模式、转录谱、代谢特征。. 主要结果有（1）TUNEL可视化研究证实刺参幼体变态过程会发生明显的细胞凋亡现象且随着发育深入逐渐增强；（2）鉴定出刺参一个新的cDNA全长2790bp、编码671氨基酸的Caspase-8同源基因，SMART分析表明蛋白序列包含1个凋亡酶催化活性结构域CASc和1个死亡受体结构域DED，进化位置提示该基因是Caspase家族的一个新成员；（3）qPCR检测到凋亡启动酶Caspases-8及其下游效应酶Caspase-3作为持家基因在刺参胚胎发育阶段是低水平的组成型表达，而从耳状幼体经樽形幼体至稚参的发育时相中呈现显著增强的诱导型表达，泛抑制Caspase会显著降低刺参幼虫Caspase-8基因在早期变态过程中的表达及其变态率，证实Caspase-8启动的细胞凋亡在刺参变态过程中发挥重要作用；Caspases-8和-3在成参呼吸树、管足、体腔细胞中的表达量高且显著高于其他组织（P＜0.05），暗示其在成体的免疫防御中具有重要功能；（4）启动酶Caspase-2和效应酶Caspase-6基因在幼体变态和成体组织中表现出近乎相同的表达模式；由此可见，凋亡相关的主要Caspases在刺参由浮游到底栖的转变过程中具有重要的调控作用；（5）组学分析查明稚参细胞凋亡、自噬的重要调控分子Caspases、Autophage proteins较大耳幼体显著上调，差异表达基因主要富集在细胞内基于微管的分子转运和纤毛的形成，参与脂类代谢、P450介导的外源性物质代谢以及吞噬作用相关的信号通路。. 这些研究结果初步揭示了Caspase-8启动、Caspase-3执行的细胞凋亡在刺参幼虫变态过程的重要作用，为深入探究海参类幼体发育机理提供靶向基因及调控网络，为海洋无脊椎动物经济类苗种培育和污损类治理提供理论指导和研究方向。