细胞外HSP70在骨髓间充质干细胞成骨分化和迁移分布中的作用与相关机制研究

The microenvironment of fracture hematomas is important for fracture healing.Our previous studies found that the concentration of extracellular heat shock protiens(eHSP70) increased in the microenvironment of fracture hematoma.To date,the exact role of eHSP70 in fracture healing has not been reported. Our previous studies found eHSP70 promoted mesenchymal stem cells(MSC) osteogenesis differentiation and migration.MSC expresses main eHSP70 receptors- - Toll-like receptors(TLRs),so we supposed that eHSP70 may infulence MSC through TLR.In this study, we will use molecular techniques, such as siRNA,gene chip, real time RT-PCR and western blot, to explore the mechanisms of eHSP70 transmember signal transmission,intracellular signal transmission and activation of related genes, all of which will infulence MSC osteogenesis differentiation and migration.This research will give us a deeper understanding of the microenvironment of fracture hematoma affecting fracture healing. And it will also give us a new way for prophylaxis,and treatment of fracture nonunion.

骨折后局部血肿微环境对骨折愈合起重要作用。我们前期研究发现骨折血肿微环境中胞外HSP70(eHSP70)含量明显升高。目前，eHSP70在骨折愈合中的作用未见报道。我们预实验发现eHSP70可以促进骨髓间充质干细胞（MSC）成骨分化和定向迁移分布。MSC表面表达eHSP70的主要受体- - Toll样受体（TLR），因而我们推测eHSP70可能通过TLR影响MSC的成骨分化和定向迁移分布。本课题欲在前期研究的基础上，应用siRNA、基因芯片、real time RT-PCR、Western blot等技术，探讨eHSP70如何实现跨膜转导的途径、胞内信号传导和相关基因活化而影响MSC成骨分化和定向迁移分布。通过本项目的研究，有助于我们深入了解骨折血肿微环境影响骨折的机制，为骨折不愈合的预防、发生和治疗提供新的途径。

热休克蛋白70（Heat shock protein 70, HSP70）参与细胞各种代谢。为了研究HSP70在干细胞成骨分化中的作用。我们首先在体外研究了外源性HSP70对干细胞成骨分化的影响。我们发现，外源性的HSP70可显著提高碱性磷酸酶的活力，同时促进钙结节的形成，且存在时间依赖性和剂量依赖性。RT-qPCR结果表明HSP70可显著促进成骨特异性的基因RUNX2，OSX和ALP的表达，WB结果显示HSP70可显著促进成骨相关蛋白SP7，ALP和BMP2的表达。基因芯片和通路富集分析提示ERK信号通路与HSP70促进干细胞的成骨分化关系密切，于是我们通过信号的通路验证，HSP70通过ERK信号通路调控干细胞的成骨分化。接着我们比较了成骨分化的干细胞与分化的干细胞的HSP70的表达水平。通过过表达HSP70基因，我们发现其可以促进干细胞特异性的成骨基因表达，增加碱性磷酸酶的活性，同时有利于矿化结节的积累。此外，我们通过大鼠的胫骨骨缺损模型，利用HSP70过表达的细胞膜片加速修复骨折。综上所述，我们发现HSP70可以加强干细胞的成骨分化能力。