弥散肿瘤细胞发生“肿瘤干细胞”样上皮间质转换在鳞癌转移中的作用机制研究

In traditional opinion, malignant tumor metastasis occurs in the advanced stage of tumor. Recent studies demonstrated that metastasis could appear at the early stages of tumor carcinogenesis and development. Disseminated Tumor Cells (DTCs) detachment from primary foci and diffuse the blood vessel, lymphatic and bone marrow, this process may initiated tumor metastasis， but the mechanism underline it has not been explored. We have established head and neck squamous cell carcinoma PIK3CA animal models by induced tissue-specific gene engineering; found that epithelial-mesenchymal transition (EMT) has happened when DTCs detachment from primary foci. DTCs can exist in the nude mice marrow and lymph nodes after tumorigenicity experiments, and express some stem cell surface markers. On this basis, the project will firstly trace and identify DTCs, which exist in blood vessels and lymphatic by in vivo fluorescent labeling and flow cytometry. Analyze the genomic differences among DTCs, primary tumor cells and metastatic tumor cells with array-CGH (comparative genome hybridization). Assess the function of EMT in DTCs generation by down-regulated EMT regulating gene Twist, and RT2 Profiler PCR array is employed to determine the characteristics of cancer stem cells in DTCs and screen stem cell-secreted growth factor. The tumorigenic ability of DTCs in vivo and in vitro will be detected. This research can offer theory and experiment foundation for clinical monitoring and target to control tumor matastasis.

传统认为恶性肿瘤转移发生在晚期，而近期研究提示转移在肿瘤发生发展早期即可以出现，弥散肿瘤细胞(DTCs)从原发灶脱落并弥散于血行、淋巴道及骨髓可能启动了转移过程，但机制尚不清楚。本课题组前期建立了诱导型组织特异性基因工程上呼吸消化道鳞癌PIK3CA动物模型，发现DTCs从原发灶脱落时发生了上皮间质转换（EMT），经成瘤实验后可存在于裸鼠骨髓和淋巴结中，并表达某些干细胞表面标记物。本项目将在此基础上，采用体外荧光标记法及流式细胞技术追踪特定淋巴道和血行中的DTCs，利用array-CGH技术进行DTCs与原发灶及转移灶肿瘤细胞的基因组差异研究，通过下调EMT调控基因Twist以评估EMT在DTCs生成中的作用，利用RT2 Profiler PCR技术确定DTCs的肿瘤干细胞特性并筛查干细胞分泌型生长因子，最后检测DTCs在体内和体外的成瘤能力，为临床监测和靶向控制肿瘤转移提供理论和实验基础。

本课题利用激活种系和靶基因种系，成功地建立了高转移的头颈鳞癌模型。然而在诱导头颈鳞癌过程中，部分小鼠有腮腺肿瘤的发生，虽然为我们研究鳞癌特异性弥散肿瘤细胞带来一定的困难，但由于目前世界上尚没有转基因唾液腺肿瘤小鼠模型，唾液腺肿瘤的发生是我们的意外收获，因此我们将制作唾液腺肿瘤模型作为研究重点，结合人唾液腺肿瘤临床标本以及细胞系，有望在揭示唾液腺肿瘤发生的分子机理方面有重大发现。.唾液腺小鼠模型结果显示，PTEN单缺失可引起多形性腺瘤的发生，PTEN与Smad4双缺失可引起唾液腺腺样囊性癌的发生。因此我们首先检测PTEN和Smad4在常见唾液腺肿瘤中的表达及定位。组织学结果显示，在多形性腺瘤中，PTEN特异性表达在肌上皮细胞中，Smad4特异性表达在腺上皮细胞，两者表达无重叠。在腺样囊性癌中，尤其是实性型中，约80%的病例出现了PTEN和Smad4表达的双缺失，并伴有PI3K信号通路的激活。结合动物模型结果，我们推测在唾液腺肿瘤中，PTEN单独缺失，只会形成良性肿瘤，但PTEN和Smad4同时缺失，可形成腺样囊性癌。相对于Smad4，PTEN在腺样囊性癌的发生发展中起着关键性的作用。体内外研究结果显示特异性阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路后，虽然可有效的抑制肿瘤细胞的增殖能力进而抑制裸鼠移植瘤的生长，但对于抑制肿瘤肺转移能力并不显著。.在对PTEN调控腺样囊性癌转移机制的研究中，利用基因芯片技术筛选出PTEN缺失的SACC83中差异表达基因WDR66，组织学结果显示WDR66在实性型腺样囊性癌中呈高表达，并与PTEN的表达呈显著负相关，同时WDR66高表达的腺样囊性癌患者可能存在一个较差的预后。体外研究结果显示WDR66可有效的抑制肿瘤细胞的侵袭及迁移能力，并且还赋予了肿瘤细胞获得自我更新能力而具有了干细胞的特性，免疫共沉淀结果显示WDR66是PTEN的直接靶基因。以上结果提示PTEN通过抑制通路的激活进而抑制肿瘤细胞的生长，通过直接负调控WDR66进而影响肿瘤细胞的侵袭迁移及获得干细胞的能力。 .该研究成果为深入探讨PTEN抑制腺样囊性癌的发生发展及转移的分子机制提供了重要的理论依据和研究方向，能为用于临床治疗唾液腺腺样囊性癌的潜在药物的研发提供新线索；同时，根据患者PTEN-WDR66轴的表达特异性，提供个体化用药的治疗方案。