基于液滴微流控技术前纤维蛋白2（PFN2）对肺癌血管生成的调控作用及其机制研究

The occurrence, development, invasion and metastasis of lung cancer depend on its angiogenesis. Tumor angiogenesis involves complex intercellular interactionsin the microenvironment including tumor cells, macrophages, endothelial cells, etc.. The existing research platforms have certain limitations in microscale bionics and high-throughput detection. The droplet-based microfluidic technology can provide an effective analytical platform for the study of the function and mechanism of tumor angiogenesis in high-throughput bionics. We have previously developed a 3D−2D coculture droplet array system to analyze tumor sprouting angiogenesis by droplet microfluidic technology, in which ECs are cultured in a monolayer and Lung cancer cells and macrophages are cultured in 3D by loading in Matrigel. Moreover, we constructed a coculture droplet array by using the automated SODA (sequential injection droplet array) system for high-throughput detection. We found that profilin2 (PFN2) expression was significantly increased in lung cancer and was closely related to the prognosis of lung cancer patients. In addition, PFN2 is indispensable in the process of lung cancer angiogenesis. Knockdown of PFN2 expression in lung cancer cells can effectively inhibit angiogenesis, and its VEGF mRNA expression and protein secretion are significantly reduced. This project aims to establish a droplet microfluidic based biomimetic lung cancer angiogenesis model, and systematically explain the key molecules and signal networks of PFN2 regulating lung cancer angiogenesis. These data may provide new ideas for exploring the mechanism of lung cancer angiogenesis and guiding clinical treatment.

肺癌的发生发展均依赖于其血管生成。肿瘤血管生成涉及微环境中肿瘤、巨噬、内皮细胞等多种细胞间复杂的相互作用。现有研究平台在微尺度仿生及高通量检测方面有一定的局限性，液滴微流控技术为高通量仿生进行肿瘤血管生成的作用与机制研究提供了有效的分析平台。我们前期利用该技术建立了包含肺癌细胞与巨噬细胞的3D肿瘤-2D内皮的肺癌血管生成仿生模型，利用顺序操作液滴阵列（SODA）系统进行高通量血管生成分析。我们发现前纤维蛋白2（PFN2）在肺癌中的表达显著增高，与肺癌患者的预后分期存在密切联系。基于液滴的细胞功能实验证实，PFN2在肺癌血管生成的过程中不可或缺，敲低肺癌细胞中PFN2表达可有效抑制其诱导的血管生成，其VEGF的mRNA表达和蛋白分泌量显著降低。本项目旨在建立基于液滴微流控技术的肺癌血管生成仿生模型，系统阐述PFN2调控肺癌血管生成的关键分子和信号网络，为探讨其机制，指导临床治疗提供新的思路。

肺癌的发生发展及转移均依赖于其血管生成。前纤维蛋白2（PFN2）在肿瘤细胞中高表达，与肿瘤的发生、迁移及侵袭程度相关；在肺癌中通过表观遗传机制，促进TGF-β1诱导的上皮间质转化及VEGF和CTGF的表达，然而，VEGF是血管内皮生长因子，PFN2在肺癌血管生成的作用与机制尚不明确。. 我们发现PFN2在肺癌中的表达显著增高，与肺癌患者的预后分期存在密切联系；其缺失抑制了肺癌细胞增殖及其诱导的血管生成。考虑到缺氧是包括肺癌在内的所有实体肿瘤微环境的重要特征，我们对前期构建的基于液滴微流控芯片的肿瘤血管生产模型进行改造，并对其缺氧状态进行表征，使其成为一个可以模拟实体肿瘤的尺寸及肿瘤内部的缺氧状态的类在体模型。利用该模型我们进行了机制探究。PFN2是一种非常保守的肌动蛋白结合蛋白，其结构域特点决定PFN2具有控制复杂分子相互作用网络的枢纽功能。因此，我们利用免疫共沉淀结合质谱分析挖掘潜在的关键蛋白，并关注到PKM2分子。接下来我们利用IP、SPR、分子对接等多种技术手段验证PFN2与PKM2的结合，并找到两者的结合位点Y134和S138。既往研究表明，PKM2在缺氧条件下可转移到细胞核内，并作为HIF-1α和NF-κB的转录共激活因子，调控下游靶基因的表达。我们发现PFN2敲低抑制了PKM2核易位，核易位相关的蛋白ERK1/2、p-S37-PKM2也下调，并且，即便给予EGF刺激，ERK1/2、p-S37-PKM2表达恢复的情况下，PKM2核易位受抑制的情况依然存在。进一步研究发现，PFN2敲低干预了PKM2/HIF-1α/NF-κB复合体的形成；PFN2与PKM2的结合是PKM2核易位所必须的，并且影响血管生成。本项目利用基于液滴微流控技术的肺癌血管生成仿生模型，系统阐述PFN2调控肺癌血管生成的关键分子和信号网络，为探讨其机制，指导临床治疗提供新的思路。. 除以上研究工作外，我们在分析PFN2结合蛋白时同时关注到了脂肪酸结合蛋白5(FABP5)和多聚腺苷酸结合蛋白1（PABP1）分子。考虑到这两个蛋白在肿瘤代谢及合成方面具有重要的作用，其作用的发挥是否依赖于PFN2蛋白尚无定论，因此我们就PFN2-FABP5和PFN2-PABP1的相互作用及其生物学功能做了进一步探索。