YAP1和NEK2在第三代EGFR-TKI耐药中的功能和机制研究

Lung cancer is one of the most harmful malignant tumors to human health, and its mortality rate ranks first in the death rate of malignant tumor. Recently, molecular targeted drugs Epidermal Growth Factor-Tyrosine Kinase Inhibitor (such as Gefitinib or Osimertinib) are showing a rapid onset, good curative effect in lung adenocarcinoma. However, in the long term treatment of lung adenocarcinoma, the problem of acquired drug resistance is inevitable, resulting in tumor recurrence, which has become one of the main bottlenecks affecting the treatment of lung cancer. Therefore, by utilizing CRISPR/Cas9 screening technology in genome-wide scale, we systematically studied EGFR-TKI drug resistance genes in the treatment of lung adenocarcinoma.For two top ranking genes YAP1 and NEK2, we validated drug resistance function by molecular experiment. The two genes were confirmed to related to Osimertinib resistance. Therefore, by integrating and analyzing ChIP-seq and RNA-seq and GRO-seq data, for the construction of EGFR-TKI resistance gene regulatory network is of great significance to explain the mechanism of resistance to EGFR-TKI and to guide clinical individualized treatment.

肺癌是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤死亡率之首位。近来， 分子靶向药物表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(如吉非替尼或奥西替尼)在肺腺癌的治疗过程中，呈现出起效快、疗效好等特点。但是，在肺腺癌的长期治疗过程中，仍不可避免的出现获得性耐药问题，导致肿瘤复发，已成为影响肺癌治疗的主要瓶颈之一。因此，我们通过运用CRISPR/Cas9筛选技术在全基因组范围内，系统地挖掘了在肺腺癌治疗过程中与EGFR-TKI耐药性相关的基因，其中，对于排名靠前的两个基因YAP1和NEK2进行了耐药功能的初步验证实验，确定了两个基因的确跟奥希替尼耐药相关，因此，接下来通过整合分析ChIP-seq以及RNA-seq和GRO-seq数据，为构建EGFR-TKI耐药基因调控网络，对阐释EGFR-TKI耐药机制及指导临床个体化治疗有着重要的意义。

方法：我们设计了一个针对人类 357 个表观遗传调节因子的 EpiDrug sgRNA 文库，并将该靶向 sgRNA 文库应用于 2D 细胞培养和 3D 异种移植模型中的关键基因筛选。我们随后选择了只能在体内识别的目标进行验证。我们还研究了由靶敲除引起的体内特异性表型的潜在机制。最后，我们探讨了用小分子抑制剂治疗选定靶点的临床意义。. .结果：我们将 YAP1 确定为在体外和体内模型之间赋予差异重要性的基因。敲除 YAP1 对 2D 细胞培养中的细胞增殖没有影响，但在人肺和结直肠腺癌细胞系的异种移植模型中显着促进肿瘤生长。在同基因结肠癌模型 CT26 中，敲除 YAP1 导致免疫缺陷小鼠的肿瘤生长更快，但免疫能力小鼠的肿瘤生长减少。从机制上讲，敲除 YAP1 可导致其相互作用伙伴 NEK2重新分布，以重复染色质中的区域并刺激双链 RNA 的表达。这导致了病毒模拟反应，它激活了一组参与细胞因子-细胞因子受体相互作用的基因。单细胞 RNA-seq 和 CyTOF 分析显示，细胞因子的激活分别在免疫缺陷和免疫活性小鼠中诱导肿瘤促进中性粒细胞和肿瘤抑制 CD8+ T 细胞浸润。使用来自 TCGA 的患者数据，我们发现 YAP1 的表达水平与大多数癌症类型（包括肺癌和结直肠腺癌）中的中性粒细胞和 CD8+ T 细胞肿瘤浸润呈负相关。一种针对 YAP1-NEK2 相互作用的小分子抑制剂显着降低了免疫活性小鼠 CT26 肿瘤的生长，但其表型被 CD8 中和抗体逆转。最后，我们证明了抑制剂与抗 PD-L1 抗体的强协同作用。. .结论：我们的研究证明了体内 CRISPR 筛选在识别调节肿瘤-微环境相互作用的治疗靶点方面的效用，并将 YAP1 确定为单独或与免疫疗法组合的有前景的治疗靶点。