转录因子Gfi1对NLRP3炎性复合体的负性调节机制研究

脓毒症是感染引起的全身炎症反应失控，IL-1β等炎性因子大量产生是其重要发病机制之一。炎性复合体是近来发现的一种大分子蛋白复合体，可调节IL-1β前体水解剪切而影响其活性。对炎性复合体调控机制的研究目前集中于其活化机制，其负性调控机制尚未阐明。我们前期证实转录因子Gfi1有负性调控炎症反应的作用，可抑制IL-1β的生成，并在炎性复合体关键蛋白NLRP3的启动子区发现了Gfi1的潜在结合位点，由此提出"Gfi1负性调节炎性复合体"的假说。本项目从全新的视角探讨对炎性复合体自身表达的调节机制，拟以Gfi1为切入点，以Gfi1-/-骨髓巨噬细胞为研究对象，采用EMSA、ChIP、实时定量PCR等分子生物学方法，从Gfi1与NLRP3启动子结合、NLRP3转录、翻译、炎性复合体活化以及炎症因子成熟释放等，多层次探讨Gfi1对炎性复合体活性和炎症因子生成的调节，为治疗脓毒症提供新的思路和药物靶点。

脓毒症是感染引起的全身炎症反应失控，炎性因子IL-1β大量产生是其重要发病机制之一。IL-1β的生成主要受炎性复合体调控，我们前期工作提示转录因子Gfi1能调节炎性复合体NLRP3蛋白表达，本课题通过多种实验方法充分明确了Gfi1对NLRP3炎性复合体的调节机制。我们分离正常（WT）和Gfi1基因敲除小鼠（KO）骨髓巨噬细胞进行体外刺激，发现与WT相比，Gfi1-KO的巨噬细胞分泌IL-1β大幅提高。免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示，Gfi1-KO的巨噬细胞中IL-1β成熟体和caspase-1剪切体的表达，以及NLRP3 mRNA表达水平都明显高于WT，提示Gfi1在转录水平影响NLRP3的表达。采用双荧光报告实验结合NLRP3突变启动子，进一步明确Gfi1通过NLRP3启动子区GRE1位点（nt -1210/-1207）抑制NLRP3转录。EMSA和ChIP实验进行进一步从体内、体外证实了该结论，证明Gfi1通过GRE1元件直接调控NLRP3基因转录。此外，我们在NLRP3启动子区还发现两个潜在的NF-κB p65结合元件。通过双荧光报告和EMSA实验证实p65通过NRE1元件促进NLRP3转录，Gfi1竞争抑制NF-κB p65 与NRE1元件的结合，从而抑制p65对NLRP3的转录活化。综上，我们提出Gfi1对NLRP3表达的“双重调节模式”机制。本研究在以往报道基础上，充分明确了Gfi1对IL-1β表达和分泌的调节机制，表明Gfi1在转录和翻译水平调节IL-1β生成方面扮演关键角色。这些发现为临床抗炎治疗和控制IL-1β介导的脓毒症损伤提供了新的思路和药物靶点。