内质网应激（ERS）在压应力加载所致的髁突软骨生理改建/病理变化过程中的作用及其机制研究

ERS，即内质网应激，是机体对外界刺激的先发反应,它在决定细胞的结局如适应、凋亡中起着重要作用。近年来有关ERS的研究非常活跃，但在软骨细胞甚少。现在观点认为适度压力刺激髁突软骨生理改建，过度压力刺激却导致病理变化，这是怎样的机制在起作用？在前期研究中，我们通过蛋白组学方法筛选出一批与ERS有关的蛋白分子，由此推测ERS在压力下髁突软骨的生物反应过程可能扮演关键角色。为验证这一科学假想，本研究利用现有的体内、外压力加载模型，结合ERS诱导剂和抑制剂进行分组，明确ERS在其中的作用；测定髁突软骨功能状态和ERS效应蛋白变化的关系，揭示ERS的作用机制；通过荧光共振能量转移（FRET）技术观察ERS信号通路PERK/elF2α的动态变化，利用siRNA技术干扰其活性，探索新的治疗手段。本项目旨在揭示压力刺激下ERS在髁突软骨的作用及机制，为了解颞下颌关节的生理改建/病理变化过程提供科学依据。

本研究利用体内、外力学加载模型，结合内质网应激（ERS）诱导剂Tm和抑制剂Sal来明确ERS作用，以及与加力时间、大小的效应关系。体外研究结果表明Tm能诱导ERS发生，大鼠髁突软骨细胞凋亡增加，ERS分子GRP78/GRP94，CHOP，Casepase-12表达明显上升；Sal能有效地降低上述分子的表达来保护髁突软骨细胞，减少凋亡发生。体外周期性牵张力CTS刺激下，12%CTS作用24h后未能引起大鼠髁突软骨细胞凋亡的明显增加，ERS标志分子无明显变化，但CTS与Tm联用后ERS标志分子表达较单纯Tm组升高，提示12%CTS仅能增加大鼠髁突软骨细胞ERS反应的敏感性。20% CTS作用24h后，大鼠髁突软骨细胞凋亡增加，ERS标志分子表达上升，sal对大鼠髁突软骨细胞起保护作用，提示较大力值才能引起ERS发生。根据体外结果，我们独创了压力加载大鼠髁突软骨模型，与Tm和sal联用，分轻压力组和重压力组，加力时间为1，3，7天。结果表明轻力组髁突软骨随着加力时间延长出现了缓慢变薄，细胞内质网扩展，胶原断裂；细胞增殖蛋白Ki67加力1天后轻度上升然后迅速下降，细胞凋亡在1天迅速增加，后期凋亡不明显; GRP78/GRP94表达下降；Tm能加重髁突软骨降解，细胞增殖活性降低，凋亡加重，GRP78/GRP94表达下降； sal能缓解大鼠髁突软骨的降解，促进细胞增殖活性的回复，早期有效的减少凋亡，促进GRP78/GRP94表达；重力组髁突软骨的降解更早也更迅速，超微结构变性，细胞增殖活性下降但不如轻力组明显；随着加力时间延长髁突软骨凋亡增加明显，GRP78/GRP94表达下降；Tm能加重此病理效应和细胞增殖蛋白变化，早期能促进凋亡，进一步下降GRP78/GRP94表达；sal能有效改善髁突软骨的变薄，其在加力早期主要是促进增殖，后期减少凋亡，促进GRP78/GRP94表达。最后，我们对ERS相关钙离子信号在此过程中作用进行了研究。体外结果表明Tm能诱导Ca离子升高和细胞凋亡发生，不同钙离子抑制剂有少量协同作用，能有效缓解钙离子失调，下降上述ERS分子表达来减少细胞凋亡。体内结果也表明加力能诱导大鼠髁突软骨的钙离子升高，钙离子抑制剂能缓解髁突软骨的变薄效应。本研究主要是证实了ERS通路在压应力下髁突软骨病变中的作用机制，为后期TMJOA深入研究提供基础。