木薯14-3-3蛋白磷酸化在块根淀粉积累过程中的功能研究

The 14-3-3 proteins are key regulatory molecules in plant, and play important roles in carbohydrate metabolism. Research on Arabiodopsis thaliana have proved that 14-3-3 proteins had found multisite of phosphorylation, and phosphomimetic mutagenesis of a 14-3-3 protein prevented 14-3-3-mediated inhibition of phosphorylated nitrate reductase. However, fuctional analysis of phosphorylated 14-3-3 proteins on starch accumulation is limited. Simultaneously, our previous results showed that 14-3-3 protein identified from cassava tuberous roots had certain effect on starch accumulation, and some 14-3-3 proteins had been phosphorylated at different development stages of cassava tuberous roots. Hence, we bring forward an assumption that the activity of 14-3-3 family proteins might be regulated by phosphorylation, and then play important roles on the process of starch accumulation in cassava tuber by activating or inhibiting target proteins. Therefore, in this project, we firstly aim to isolate the members of 14-3-3 family proteins from cassava tuberous roots, and then determine their expressional patterns, detect their phosphorylation sites and abundance during different development stages of cassava tuberous roots. After that, we plan to mutant some phosphorylation sites of 14-3-3 proteins, and verify the detail biological functions of different phosphorylation sites on starch accumulation in transgenic Arabiodopsis thaliana. These prospective results will basically clarify the new molecular mechanism of 14-3-3 protein phosphorylation on the process of starch accumulation in cassava root, and provide candidate genes and theoretical basis for obtaining new varieties of transgenic cassava with higher yield of cassava starch.

14-3-3蛋白是生物体内重要的调节分子，在植物碳水化合物代谢中起重要作用。拟南芥中研究发现14-3-3蛋白家族发生了多位点磷酸化，且改变磷酸化位点会影响其功能发挥，但14-3-3蛋白磷酸化在淀粉积累过程中的作用还未见报道。我们前期研究结果显示，木薯14-3-3蛋白对淀粉积累过程有一定的影响，且其在块根不同发育时期发生了不同程度的磷酸化，因此推测木薯14-3-3蛋白可能通过不同位点或不同程度的磷酸化来调节其活性，调控块根中淀粉积累过程。本项目采用磷酸化蛋白质组学、分子生物学等技术，克隆木薯块根中14-3-3蛋白家族基因，分析其在块根不同发育时期的表达规律，磷酸化位点及磷酸化程度；并利用拟南芥来验证磷酸化位点发生突变后的14-3-3基因对淀粉积累的影响。研究结果将揭示14-3-3蛋白磷酸化在调控木薯块根淀粉积累过程中的可能分子机理，进而为获得高产的转基因木薯新品种提供新的理论基础。

14-3-3蛋白是生物体内重要的调节分子，在植物碳水化合物代谢中起重要作用。前期研究显示，木薯14-3-3蛋白对淀粉积累有一定影响，且在块根不同发育时期发生了不同程度的磷酸化，因此推测其可能通过不同位点或不同程度的磷酸化来调节其活性，调控块根中淀粉积累过程。本项目采用磷酸化蛋白质组学、分子生物学等技术，克隆木薯块根中14-3-3蛋白家族基因，分析其在块根不同发育时期的表达规律，磷酸化位点及磷酸化程度；并利用拟南芥来验证磷酸化位点发生突变后的14-3-3基因对淀粉积累的影响。通过研究，我们克隆到14个木薯14-3-3蛋白家族成员（分别命名为ME1433 Y1-Y14），发现不同家族成员在块根不同发育时期呈现出不同的表达规律。通过质谱鉴定发现，在14个木薯14-3-3蛋白家族成员中共有10个家族成员发生了磷酸化修饰现象，且不同家族成员在块根发育不同时期发生了不同位点的磷酸化。随后，选取ME1433 Y3中位于螺旋3上的Ser65，螺旋6上的Ser160，以及螺旋9上的Thr235进行点突变后转化拟南芥，对转基因纯合株系的淀粉含量测定结果显示，ME1433 Y3可在整体上降低转基因株系的淀粉含量，Ser65位点突变不能改变ME1433 Y3转基因株系的淀粉含量，但Ser160和Thr235位点突变可部分提高ME1433 Y3转基因株系的淀粉含量，达到与对照植株相当的水平；ME1433 Y3不同位点突变的转基因可能影响了淀粉代谢途径中不同基因的表达或活性，从而表现出不同的淀粉积累情况。这些研究结果揭示了14-3-3蛋白磷酸化在调控木薯块根淀粉积累过程中的可能分子机理，进而为获得高产的转基因木薯新品种提供新的理论基础。