干细胞分化心肌细胞的三维视频显微成像研究

The proposed research addresses a significant problem in cardiac regenerative medicine, the contractile properties of stem cell-derived cardiomyocytes. The proposed technique has unique capabilities for establishing an in vivo-like cardiac-cell construct in an in vitro cocultural environment and capturing green-fluorescence protein and second harmonic generation images in real time to visualize the formation of myofibrils. The technique to be developed in the proposed research provides a platform technology for any biological problem where real-time visualization of structure and marker expression in multicellular tissue constructs is essential. The objective of the proposed research is to explore whether stem cell-derived cardiomyocytes will have the same pattern of contractile-mechanism formation as a native cardiomyocyte and/or the ability to generate a contraction force that is similar to that generated by a native cardiomyocyte. The specific aims are: 1) To develop a spatial light modulator-based rapid scanning, three-dimensionally addressable, two photon and second harmonic generation confocal microscope for dynamic myofibril imaging; 2) To utilize a novel laser cell patterning and a surface patterning techniques to build tissue constructs in vitro on a distensible substrate; and 3) To combine the cell patterning and rapid scanning techniques to investigate myofibrillogenesis in both stem cell-derived and native cardiomyocytes under mechanical stretching and electrical triggering. The success of the proposed research will provide data for the solution of the stem cell-based cardiac regenerative medicine.

干细胞向心肌细胞的分化是心肌再生医学领域中的重大科学问题。研究干细胞到心肌细胞的功能性分化，尤其是分化心肌细胞的收缩功能目前面临两大困境：1）没有合适的光学成像方法；2）没有合适的细胞培养模型。我们首次利用非线性光学显微成像技术揭示了鼠原生心肌细胞的肌原纤维形成机制。本项目提出并发展一种具有多目标寻址和细胞区域匹配面激发功能的三维时空同步聚焦视频SHG/TPEF复合成像技术和系统；利用多光束激光诱导细胞微排列技术在弹性基底上规则排列细胞，构建类在体的心肌细胞-干细胞共培养模型；通过对共培养的干细胞的分化和收缩过程的高速三维立体光学成像记录，研究在机械拉伸和电刺激条件下干细胞分化的心肌细胞和原生心肌细胞的肌原纤维的形成过程以及收缩功能相关参数，揭示干细胞功能性分化为心肌细胞的机理。本项目研究将为细胞相互作用过程的研究提供重要光学手段，为发展新一代的心肌再生医学治疗方案提供重要的科学依据。

心脏病目前仍是威胁人类健康的主要疾病，虽然心脏病起因众多，但导致死亡的心脏病的最后表象都是由于大量心肌细胞（心肌收缩力的来源）受损而造成的心衰 ——心肌无法提供足够的收缩力。心肌细胞自身不能再生；而且临床证据表明：当心脏处于病变（例如心肌梗塞）的情况下，机体无法大面积修复受损的心肌细胞，因此与心血管有关的疾病一直是包括我国在内的许多国家的头号健康杀手。.最近，体外和体内的实验结果证明：干细胞可以分化为心肌细胞。因此，近期人们提出了基于干细胞植入的心脏病治疗术：将干细胞注入病变心脏组织以求心肌再生。虽然干细胞植入研究的近期结果已经证明了“干细胞植入会引起心脏功能的部分或短期改善，”但是，基于干细胞植入的心脏病治疗术仍面临着两大难题：1）分化成心肌细胞的干细胞仅占植入干细胞的极少部分；2）由干细胞分化成的心肌细胞的收缩功能尚无法确定。其原因主要包括：1）没有合适的光学显微成像方法；2）没有合适的类在体心肌细胞和干细胞共培养模型。.在成像方法方面，本项目提出并搭建了具有多目标寻址和细胞区域匹配面激发功能的三维视频SHG/TPEF复合成像方法与系统。根据视场中所有感兴趣的细胞的形貌和位置，利用空间光调制器产生匹配的激发光图案，结合时间聚焦技术对这些细胞同时快速SHG/TPEF断层成像，并利用高精度压电扫描器快速轴向扫描，实现快速三维成像；提出了目标寻址匹配的结构光超分辨显微成像技术。通过空间光调制器产生±1级衍射光，在样本上干涉形成条纹图案激发荧光，由SCMOS探测，通过结构光算法重构出超分辨图像；提出并搭建了细胞应激响应的SPR显微成像方法和系统。利用等离子体共振技术实时获取细胞应激响应，实现了细胞贴壁情况变化动态检测。.在应用方面，本项目搭建了基于SLM的多光束激光诱导细胞排列装置，实现了干细胞与心肌细胞共培养，研究了其力学收缩特性，并对比研究了生理和病理条件下肌原纤维晶体结构参数变化，研究结果对心脏病早期诊断具有重要价值。