癫痫脑内突触连接异常的肌动蛋白骨架重构机制

癫痫脑内突触连接发生持久的结构性改变，是引起学习、记忆和认知性障碍的重要机制之一。癫痫急性发作时树突棘形态异常，并伴有中枢F-actin显著下降，可能与这种突触连接异常有关，但是由于缺乏理想的检测手段，目前对癫痫中F-actin机制研究甚少。根据F-actin分布规律和癫痫发病特点，我们认为把F-actin异常全部归因于树突棘是不全面的，在突触水平上应该同时存在突触前和突触后两种机制；另外，F-actin降解不会一直持续下去，而是还要经历复杂的重构过程进而打乱既有的神经环路。我们开发了一个有效而特异的F-actin检测技术Phalloidin-based FITC-anti-FITC系统，本课题将采用该技术，结合突触前后标记及蛋白检测方法，通过研究F-actin在癫痫病理进程中的时空变化规律，探讨干预F-actin重构治疗癫痫和防止突触异常重建的可行性和关键期，为攻克癫痫提供新的理论依据。

癫痫是脑内神经元突发性同步放电引起的暂时性脑功能失常，多伴有海马神经元迟发性和持续性死亡。神经元结构和功能高度依赖F-actin骨架，因此解析癫痫脑内F-actin的变化将有助于阐明癫痫迟发性神经元死亡的分子机制。1化学点燃是一种通过反复给予亚惊厥剂量兴奋药物引起的慢性癫痫模型。点燃动物没有典型的自发性发作，但是对惊厥刺激的易感性增高。通过Phalloidin标记点燃后的C57小鼠海马，我们发现点燃小鼠海马F/G比值显著上调，CA3区透明层F-actin阳性颗粒数目明显增多。但是，点燃小鼠CA1-CA3区锥体细胞只出现轻度缺失，齿状回及CA3区没有明显的苔藓纤维发芽现象。2癫痫持续状态（SE）模型是指一次给予致惊厥剂量的刺激导致动物出现持续的、反复的抽搐，并且癫痫持续状态后动物会出现类似人类颞叶癫痫的反复自发性发作。在匹鲁卡品诱导的SE模型中，我们发现C57小鼠海马苔藓纤维-CA3区F-actin整体水平下降，而F-actin阳性结构的面积却显著增加。共定位分析表明，F-actin的这些改变主要发生在CA3区透明层的树突棘内。3由于C57小鼠并未出现典型的癫痫硬化改变，我们又使用ICR小鼠制作SE模型。结果表明，ICR小鼠对pilocarpine更敏感，能够诱导出海马硬化等典型的病理改变。8周龄ICR小鼠的最佳体重为20-22g，最佳注射剂量为300mg/kg。4采用ICR小鼠SE模型，我们系统地分析了F-actin在癫痫发展中的变化规律。SE6小时后即可在海马齿状回门区检测到F-actin解聚现象；而CA1-CA3区内F-actin的降解则发生在SE24小时之后。不同海马区域F-actin的变化遵循共同的规律：首先，树突棘内F-actin发生持续性降解，随后F-actin在树突干和细胞核周围出现短暂性聚集，最后，F-actin从死亡的神经元内完全消失。在F-actin异位聚集之后，神经元细胞核内发生DNA断裂，出现不可逆的死亡。5通过F-actin超微检测技术及双重染色分析，我们发现F-actin不仅分布在树突棘内，而且也存在于突触前轴突终末内。在SE小鼠海马内，F-actin进行性减少主要发生在突触后树突棘内。6通过静脉注射FK 506，我们发现FK506在一定程度上可以减轻pilocarpine诱导的神经元丢失，同时还能够显著地减轻F-actin的受损程度。