马铃薯转化酶StInv1及其抑制子StInvInh2与SnRK1复合物互作对转化酶活性的调节功能和机制解析

Cold-induced sweetening (CIS) of tubers is a major trail affecting potato processing quality. Our results indicated that activity of invertase StInv1 was a key factor regulating the CIS of potato tubers. In addition, the StInv1 and its inhibitor, StInvInh2, interacted with StSnRK1α1 and StSnRK1β1, respectively. The StSnRK1α1 and StSnRK1β1 are two subunits of plant kinase SnRK1 complexes. We speculate that StInv1 and StInvInh2 may be substrates of SnRK1 complexes and the StInv1 activity may be affeted by phosphorylation of StInv1 and StInvInh2. However, the interaction between them and the regulational mechanism of StInv1 activity is still unclear. In present project, the pattern of the interaction among StInv1, StInvInh2, StSnRK1α1, and StSnRK1β1 will be clarified by the bimolecular fluorescence complementation. The roles of StInvInh2, StSnRK1α1, and StSnRK1β1 will be confirmed in CIS of potato tubers by the transgenetic approach. Combined with the analysis of protein activities in vitro and in vivo, the regulational mechanism of StInv1 activity will be exploited. The results will deepen our understanding in the melocular mechanism of CIS and will provide novel strategies and the gene resourses for improving potato processing quality.

马铃薯块茎低温糖化是影响加工品质的主要性状。前期研究表明，转化酶StInv1活性是调节低温糖化的关键因子。现已明确StInv1的抑制子为StInvInh2，它们分别与StSnRK1α1和StSnRK1β1互作。序列分析表明StSnRK1α1和StSnRK1β1属于植物激酶SnRK1复合物的α和β亚基，但它们之间的互作模式及作用机制仍不完全清楚。本研究拟以双分子荧光互补鉴定SnRK1复合物与StInv1和StInvInh2之间的互作模式，以超量表达和基因沉默技术鉴定StInvInh2、StSnRK1α1和StSnRK1β1在马铃薯块茎低温糖化中的功能，结合体外重组蛋白磷酸化活性研究，进一步解析StInv1活性调节的机制。本研究重点阐明StInv1活性翻译后调节机制，补充和完善马铃薯低温糖化的分子机理，为马铃薯品质改良提供新基因资源和新途径。

马铃薯块茎低温贮藏导致还原糖的积累是引起油炸加工产品色泽褐化和丙烯酰胺形成的重要因子。液泡酸性转化酶StvacINV1活性是调节低温糖化的关键因素，翻译后水平的活性调节方式在低温糖化中起重要。本研究确证了StvacINV1，转化酶抑制子StInvInh2以及SnRK1蛋白之间的互作关系，通过在体外和体内分别研究了StInvInh2和SnRK1调节转化酶活性的机制及其在马铃薯抗低温糖化中的功能。主要结果如下：.1. 转化酶抑制子在低温糖化中的功能及其调节机制.通过转基因研究马铃薯转化酶抑制子(StInvInh2和St-Inh)在低温糖化中的功能。结果表明两个类型的抑制子均能抑制转化酶活性从而影响还原糖积累，但StInvInh2的抑制效果明显优于StInh，表明StInvInh2是调节StvacINV1活性的关键抑制子。进一步研究显示，StInvInh2转录的变化导致StvacINV1活性的改变，而没有影响StvacINV1的转录水平，并且发现StInvInh2转录变化与StvacINV1活性的变化之间存在负幂函数关系，StInvInh2在翻译后水平调节StvacINV1活性并且其转录水平决定了其抑制能力。StInvInh2通过与StvacINV1互作抑制低温贮藏块茎中StvacINV1活性从而发挥调节低温糖化的功能。.2. SnRK1在马铃薯低温糖化中功能及其调节机制.通过转基因手段在马铃薯中超量和抑制SnRK1的表达研究其在低温糖化过程中的功能。结果表明，超量表达SbSnRK1α能降低95％转化酶活性，减少90％还原糖积累，油炸薯片的色泽显著降低。体外蛋白酶活性实验结果显示，SbSnRK1β能封阻StInvInh2的抑制功能，而SbSnRK1α的磷酸化水平则能调控SbSnRK1β的功能。结合在烟草活体细胞内明确了StvacINV1，StInvInh2和SnRK1的互作关系，同时在超量表达株系中升高了SbSnRK1α磷酸化水平，降低了转化酶活性。该结果揭示StvacINV1-StInvInh2-SbSnRK1组成了一个蛋白质复合体，并通过SbSnRK1α的磷酸化水平，对StvacINV1的活性进行精细调控。.本研究在翻译后水平解析了StvacINV1的活性的精细调节机制，为抗低温糖化品质改良提供了新的基因资源和新途径。