基于循环肿瘤DNA的早期肺癌淋巴结转移相关甲基化标志物的鉴定及无创预测工具的构建

Lymph node (LN) metastasis status is the most important prognostic factor, which determines the treatment strategy. The current imaging approaches are not sufficiently precise to diagnose LN metastasis before surgery, while the invasive biopsy fails be widely used. Therefore, more precise and non-invasive methods are warranted. Methylation alteration is an optimal candidate to trace the signal from early stage tumors due to its early existence, multiple loci and stability in blood. We previously screened and identified a set of plasma methylation markers by methylation high-throughput sequencing of 150 stage I lung cancer and 150 benign lesions and established the first ctDNA-based methylation sequencing diagnostic tool for early stage lung cancer worldwide (WCLC 2017). Additionally, we defined the quantity criteria for radical LN dissection based on multi-center database (JCO 2015 & JCO 2017; IF=24). Thus, by comparing the LN-negative patients (who underwent adequate LN examination, selected from previous dataset) with a set of new enrolled LN-positive patients, we seek to screen and determine the LN metastasis specific plasma methylation markers and establish a non-invasive blood diagnostic tool based on high-sensitive realtime fluorescence quantitative PCR, to determine the lymph node status preoperatively and lead to appropriate treatment strategy.

淋巴结转移状态是早期肺癌最重要的预后因素并决定治疗策略，目前术前影像学手段无法准确判断，有创活检则难以广泛应用，因此亟需发展更准确、无创的诊断工具。甲基化变异具有早期出现、位点多、相对稳定的特点，适合在血浆中探测早期肿瘤的痕量信号，申请人在前期通过高通量甲基化测序技术从I期肺癌与良性疾病（各150例）的对比中筛选到一批甲基化标志物，建立了国际首个基于循环肿瘤DNA甲基化测序的肺癌诊断工具（WCLC 2017）。此外，申请人前期通过多中心数据分析明确了淋巴结完整清扫的标准（JCO 2015 & JCO 2017；IF=24）。本项目拟从前期标本中选取符合清扫标准（确定无淋巴结转移）的病例作为阴性对照，进一步收集淋巴结转移阳性的组织/血液进行测序，鉴定出与肺癌淋巴结转移相关的血浆甲基化位点，构建并初步验证基于高敏荧光定量PCR平台的无创诊断工具，用于术前预判淋巴结转移情况，以指导合理的综合治疗

背景：肺癌是全球癌症相关死亡主要原因，其预后与诊断时疾病分期高度相关，5年总生存率从IA期85%急降到IV期6%。因此，肺癌早筛是提高长期预后关键手段。美国国家肺筛查试验(NLST)表明，低剂量CT (LDCT)肺癌筛查在肺癌高风险吸烟者中降低20%死亡率，使LDCT工具迅速被全球广泛采用，但LDCT带来挑战是在大量良性结节中区分小比例的恶性结节(~10-20%)。大多数非侵入性早诊方法依赖于血液中存在的肿瘤源性核酸或蛋白。ctDNA对个体肿瘤有特异性，因此它可绕过与其他循环生物标志物所遇到的假阳性相关问题。研究内容：前期对119例非小细胞肺癌（NSCLC）肺结节病灶直径小于3.0 cm的组织和血浆样本进行高通量靶向甲基化测序，比较有和无隐匿性淋巴结转移（OLN）病人的甲基化谱，通过深度学习建立预测模型。同时，对389例肺结节患者血浆进行DNA甲基化测序，在140例血浆中进行独立验证，建立诊断模型，且在不同阶段和不同亚型的肺结节中评价该模型。重要结果及关键数据：在OLN队列中，27例(22.7%)经病理确认OLN+，与OLN-相比，组织和血浆甲基化差异基因878和52个，其中19个重叠，初步预测模型AUC分别为88.6% (95% CI, 87.8-89.4%)和74.9% (95% CI, 72.2-77.6%)。在良恶性结节诊断模型（命名PulmoSeek），开发并验证用于肺结节诊断的100个特征模型，该模型在140个独立验证样本上ROC-AUC为0.843，准确度为0.800。在6 ~ 20 mm直径亚组(n = 100)，性能保持良好，在10%患病率下，敏感性1.000，调整后负预测值(NPV)为1.000；I期恶性肿瘤(n = 90)，敏感性0.971；不同结节类型:实性结节(n = 78)，敏感性1.000，调整后NPV为1.000；部分实性结节(n = 75)，敏感性0.947，调整后NPV为0.983；磨玻璃性结节(n = 67)，敏感性0.964，调整后NPV为0.989，发病率为10%。该模型在鉴别良恶性结节方面优于PET-CT和现有2个临床预测模型(Mayo Clinic和Veterans Affairs)。科学意义：血液DNA甲基化模型为肺结节分类提供更好检测手段，有助于早期肺癌及OLN的准确诊断，指导临床决策。