水葫芦对富营养化水体中铵态氮吸收利用的分子机理研究

项目采用抑制消减杂交技术分离水葫芦铵态氮吸收利用相关的基因片段，并用RACE获得全长cDNA，qRT-PCR法定量分析在不同组织、不同铵态氮条件下基因转录的情况，与同样条件下蛋白质活性直接测定结果比较，分析不同组织的基因如何在转录和翻译水平上响应不同的铵态氮条件。项目还采用生物信息学方法对铵态氮吸收利用相关基因的结构与功能进行预测，并用酵母异源功能互补实验验证基因功能，对基因功能和性质进行进一步的深入的研究。研究结果从分子水平上揭示水葫芦高效吸收利用富营养化水体中铵态氮的机理，揭示水葫芦对环境的适应性及入侵的机制，为水葫芦的进一步开发利用和有效治理提供理论基础，同时水葫芦吸收利用铵态氮机理的揭示丰富了植物氮代谢营养学研究，能够为高效利用氮源的农作物品种改良提供一定的借鉴。

项目包括三个方面的工作:.1）建立了水葫芦缺氮/铵态氮正反抑制消减杂交文库。正向杂交库容量2000个克隆，反向2650个克隆，随机挑取正反向各1000个克隆测序并进行了生物信息学分析。BLASTX比对显示正向库中存在Unigene 522个，反向存在479个。缺氮条件下水葫芦一些转运蛋白和一些参与甲基化过程蛋白的基因高表达，在铵态氮条件下，一些代谢相关基因以及参与细胞骨架组成蛋白的基因高表达。COG分析显示正向库中的序列参与最多的生理过程是转运和代谢，反向库中的序列参与最多的是细胞骨架构建。GO分析的结果也显示表达差异最大的基因是转运相关及参与膜包被的一些基因。所有这些分析结果都显示水葫芦能通过有效地调控一些转运蛋白、代谢相关蛋白及骨架构建蛋白基因的表达来应对不同的氮素环境条件。.2）通过RACE方法克隆1条铵转运蛋白基因、3条谷氨酰胺合成酶全长基因序列，生物信息的方法分析这些基因序列预测其功能，通过酵母突变功能互补验证这些基因的功能，用qTR-PCR法及蛋白活性测定的方法研究这些基因在不同的组织及不同的条件下的表达，发现各种同功蛋白基因在不同的组织中具有不同的表达模式。.3）项目还采用传统培养方式结合分子生物学的方法研究了富营养化水体中水葫芦根际微生物的群落结构及不同氮素环境对根际微生物群落结构的影响，研究结果显示富营养化水体中水葫芦根际细菌的群落结构丰富，不同时段水葫芦根际细菌的丰度略有变化，主要类群为变形杆菌门。.总之，项目在分子水平上研究了富营养化水体中水葫芦铵态氮吸收和利用相关的基因序列、功能和表达，研究了富营养化水体中水葫芦根际微生物群落结构及不同的氮素对根际微生物群落结构的影响，研究结果能够为进一步开发和利用水葫芦对富营养化水体中铵态氮进行修复及从营养代谢及根际微生物角度控制水葫芦生长提供理论基础。