基于"基因密码子扩展技术"的神经轴突生长机制研究

Protrudin is a new protein associated with neurite outgrowth, which regulate vesicle trafficking to induce neurite formation. There must be many other proteins involved in protrudin regulated intracellular material transport, as protrudin is a membrane protein of acidic endosome (pH ～5). However, it is very difficult to study protein-protein interaction in acidic condition under the traditional technology. To solve the problem, "genetic code expansion technology" was used to research protein-protein interaction. In this study, the unnatural amino acid with photo crosslinking activity was site-specifically inserted into protrudin. Through photo crosslinking and mass spectrometry analysis, microtubule associated protein 4 (MAP4) was found as a new interaction protein of protrudin. Then, we plan to study role of the interaction between protrudin and MAP4 in neurite outgrowth at molecular, cellular and whole animal (zebrafish) levels. We intend to reveal the molecular mechanisms regulation network of axonal growth providing new target or theoretical support for the treatment of axonal degeneration.

Protrudin是近年新发现与神经轴突生长密切相关的一个蛋白，它通过调节囊泡运输诱导神经轴突的形成。protrudin作为酸性亚细胞器-内体（endosome，pH ～5）的膜蛋白，在调节胞内运输过程中势必与许多蛋白协同发挥作用，但受限于常规的蛋白相互研究技术的局限性，很难在酸性条件下研究蛋白相互作用。针对这一问题，我们将"基因密码子扩展技术"应用于蛋白相互作用研究领域。本项目利用该项技术，将具有光交联活性的非天然氨基酸定点引入到protrudin蛋白中，通过光照交联，捕捉protrudin新的互作蛋白，经质谱鉴定其中一个互作蛋白是微管相关蛋白4（MAP4）。进而通过基因过表达、基因沉默等技术，在分子、细胞、动物（斑马鱼）水平，研究protrudin和MAP4的相互作用及功能，揭示神经轴突生长的分子机制及网络调控，为神经轴突变性的治疗提供新的靶点或理论支持。

Protrudin是近年新发现的与神经轴突生长密切相关的一个蛋白，它通过调节囊泡运输（该过程依赖Rab11 蛋白）而诱导神经轴突的形成。Protrudin作为酸性亚细胞器-内体（endosome，pH～5）的膜蛋白，在调节胞内运输过程中与许多蛋白协同发挥作用，但受限于常规的蛋白相互作用研究技术，很难在细胞内体的酸性环境中，捕捉protrudin新的相互作用蛋白，特别是那些弱的或瞬间结合的蛋白。针对这一问题，本课题将“基因密码子扩展技术”应用于蛋白相互作用研究领域。我们结合protrudin蛋白的亲水疏水性分析和其FYVE domain晶体结构，在protrudin的27个不同位点通过定点突变的方式引入终止子TAG，构建了能够位点特异地编码光交联非天然氨基酸DiZPK的protrudin突变体质粒。将突变体质粒与编码特异识别DiZPK 的 tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒共转染HEK293T细胞使其表达DiZPK-protrudin蛋白，经Western Blot检测到已成功将DiZPK定点插入到protrudin的20个不同位点，并探讨了在不同位置DiZPK插入效率不同的原因。转染后48h，通过365 nm紫外光照细胞引发光交联反应，获得DiZPK-protrudin与相互作用蛋白间的共价交联产物，经Western Blot检测，发现E52位DiZPK-protrudin蛋白捕获到与野生型不同的protrudin-DiZPK-Protein复合物，推测该复合物内含有protrudin新的互作蛋白，经高分辨质谱进一步分析鉴定新互作蛋白为： fatty acid synthase。 进而，我们深入研究了fatty acid synthase和 protrudin蛋白功能之间的关系，阐释了protrudin诱导细胞凸起的新机制。这将对protrudin在神经轴突生长及退行性病变过程中的作用机制的探讨具有重要的理论指导意义。此外，我们扩展了研究内容，将本课题提供的技术运用在干扰素的定点聚乙二醇（PEG）修饰与腺相关病毒的靶向修饰方面，取得的不错的结果