二聚体环肽E[c(RGDyK)]2标记的靶向微泡超声增强造影无创性诊断早期肝纤维化实验研究

寻找能敏感、特异的直接反应早期肝纤维化分子病理变化的标志物, 用于无创性诊断早期肝纤维化的方法是当前研究的热点。既往研究证实肝纤维化是肝星状细胞活化与血管新生共同作用的结果，并与免疫、炎症等病理生理过程密切相关。我们的前期研究发现早期肝纤维化时活化HSC和新生血管内皮细胞中整合素αvβ3的表达明显上调，以针对该受体的特异性配体c(RGDyK)单体环肽标记的靶向微泡做为示踪剂，通过超声增强造影可以发现早期肝纤维化在影像上的异常。在此基础上，本课题将以早期肝纤维化中表达上调的受体整合素αvβ3为靶点，特异性与亲和力更强的二聚体环肽E[c(RGDyK)]2标记的靶向微泡为探针，应用高分辨率小动物超声系统进行整合素αvβ3增强造影，根据肝脏中受体结合能力信息的变化，来反映早期肝纤维化进程，探索有较高特异性、敏感性，直接反映HSC和新生血管内皮细胞的活化与数量变化，对早期肝纤维化有帮助的诊断方法。

密度梯度离心法分离大鼠原代肝脏星状细胞（HSC），体外培养诱导活化（α-SMA染色阳性）；化学药物（TAA）腹腔注射诱导大鼠肝纤维化，分析HSC和纤维化肝组织中整合素αVβ3的表达。固相合成法合成特异性更强的针对整合素αVβ3的配体（E[c(RGDyK)]2二聚体环肽），进行羧基荧光素标记或者Biotin-PEG侧链修饰，荧光示踪HSC对E[c(RGDyK)]2的摄取，流式细胞仪检测荧光强度变化，受体放射性配体结合分析（RBA）测定配体与受体最大结合容量以及亲和常数。采用成熟的Biotin-Streptavidin结合体系将E[c(RGDyK)]2二聚体环肽与微泡稳定结合；通过高分辨率小动物超声系统对早期肝纤维化大鼠肝脏进行靶向超声增强造影，研究其与病理分期的关系。随着HSC的活化，整合素αVβ3表达上调，mRNA 和蛋白质水平分别增加22 倍和7倍。正常肝组织中整合素αVβ3局限表达于门静脉周围，而肝纤维化组织中表达于扩大的门管区和纤维间隔，与肝组织内纤维化程度相关。随着早期肝纤维化程度的进展，E[c(RGDyK)]2标记的靶向超声微泡增强造影可以检测到信号增强，并与病理分期呈正相关。本研究表明二聚体环肽E[c(RGDyK)]2标记的靶向超声微泡具有更好的靶向性和亲和力。