Hippo通路在H3N2病毒感染并损伤鼻腔上皮纤毛中的作用及机制研究

Our previous study on the air-liquid interface of human nasal epithelial stem cells (hNESCs) and high-throughput sequencing (RNA-seq) showed that H3N2 influenza virus infection leads to abnormal cilia structural gene and protein expression, ciliary beating function was significantly impaired. RNA-seq also found that MST1 gene expression was significantly decreased during the late phase of H3N2 virus infection, consistent with cilia-related gene expression. MST1 is one of the core components of Hippo pathway, and Hippo pathway plays an important role in tissue repair after tissue injury. Therefore, we hypothesize that the Hippo pathway is involved in the regulation of H3N2 virus infection and damage to nasal cilia and results in impaired nasal mucosal barrier. Based on our hNESCs culture system and H3N2 virus model, we plan to silence and overexpress Hippo pathway components, such as MST1/2, LATS1/2 and YAP at different time points after infection with H3N2, and to observe the Hippo pathway on the damage and repair of nasal ciliated marker (DNAH5, DNAH11 etc.) by fluorescence microscope or ciliary structure by transmission electron microscope, which may provide new targets for treatment.

我们前期经人鼻上皮干细胞（hNESCs）气-液界面培养技术及高通量测序（RNA-seq）发现：H3N2流感病毒感染导致纤毛结构基因和蛋白表达异常，纤毛摆动功能明显受损。RNA-seq还发现，H3N2病毒感染后期MST1基因表达显著性下降，与纤毛结构基因表达一致。MST1是Hippo通路的核心组分之一，而Hippo通路在组织损伤后修复具有重要作用，因此我们推测Hippo通路参与调控H3N2病毒感染和损伤鼻腔纤毛的过程。我们拟通过hNESCs培养体系和H3N2病毒模型，在H3N2病毒感染后观察不同条件和不同时间点Hippo通路关键组分（MST1/2、LATS1/2和YAP）动态表达变化状况，并荧光显微镜观察纤毛结构蛋白（DNAH5，DNAH11等）和透射电镜下纤毛超微结构的变化，确定H3N2病毒通过Hippo通路对纤毛结构的损伤机制，为治疗提供新的靶点和手段。

不同因素造成的鼻腔纤毛结构和功能受限，可能是鼻腔鼻窦炎症发生的重要原因。本项目总体按研究计划执行，研究主体分以下两部分：（1）H3N2病毒是常见的呼吸道病毒。本研究建立了人鼻上皮细胞（hNECs）的体外气液界面培养，并使用了Poly（I：C）作为病毒成分的替代品，以模拟病毒成分对病毒感染造成的损伤后对上皮细胞重新上皮和粘纤纤毛功能的影响。我们发现hNECs的呼吸道病毒感染下调了运动性纤毛基因表达，并观察到与杯状细胞相比，纤毛细胞分化减少，纤毛生成相关标记物中的蛋白质和mRNA降低，并且在Poly（I：C）处理后，纤毛蛋白DNAH5的错误组装和错误定位增加，纤毛长度和纤毛搏动频率（CBF）也降低，提示纤毛功能受损。结果表明，hNECs的纤毛发生和纤毛功能受损可能是由病毒感染后鼻上皮再上皮化过程中宿主抗病毒应答基因的特异性表达引起的，这为将来研究病毒对呼吸道黏膜上皮的影响奠定坚实的基础。.（2）电离辐射可能损伤鼻上皮继而发炎症。本研究使用γ射线照射hNECs，构建hNECs放疗损伤后修复模型。在细胞接受放疗后1小时可以发现核内出现DNA双链断裂，DNA损伤修复标志物γ-H2AX在断裂处聚集；在放疗后不同时间点可以发现点状小灶逐渐减少，说明放疗造成的DNA双链断裂随时间推移逐渐修复。在分化后的第28天，我们观察到放疗组的细胞Ki67（细胞增殖）、p63+/Krt5+（上皮干/祖细胞）、MUC5AC（杯状细胞的分泌蛋白）、α-微管蛋白（纤毛细胞）、FOXJ1（纤毛发生相关标志物）、ZO-1（紧密连接蛋白）的mRNA表达水平与未放疗的对照组细胞相比无差异。纤毛外动力臂蛋白DNAH6的mRNA水平降低，但放疗组细胞的CBF没有显著下降。跨上皮电阻测量结果显示放疗后上皮屏障功能降低，免疫荧光结果显示细胞在受到γ射线损伤后形态发生改变。由此说明放疗会导致上皮屏障功能的缺陷，可能是接受头颈部放疗的病人更易发生鼻腔鼻窦感染的原因。.研究人员按计划书任务进行分工并合作，使项目得以顺利完成并取得成果。本项目资助发表论文11篇，每年参与或举办国内学术会议，参与专家共识撰写，加强学术交流。项目负责人以本研究为契机，与新加坡国立大学Wang De Yun教授进行深度交流合作，每年选送研究生出国学习和研究，带来先进的技术带来先进的技术和理念，共培养硕士研究生5名，博士研5名。