沙利度胺与Cereblon蛋白结合下调PI3K/Akt/mTOR信号通路治疗难治性克罗恩病

Thalidomide has been shown effective in treating refractory Crohn’s disease (CD) according to literatures and our preliminary study. But the mechanism is still unclear. Recently, Cereblon(CRBN) was identified as the primary target of thalidomide in its teratogenicity. Thalidomide binding to CRBN can induce the activation of E3 ubiquitin ligases of CRL E3 complex, which further influences its downstream PI3K/Akt/mTOR（mTOR）pathway. In our previous studies, we demonstrated that PI3K/Akt/mTOR pathway was activated in active CD patients and downregulation of this pathway could alleviate the colonic inflammation in experimental colitis mice. Taking literature reports and our previous studies together, we speculate that CRBN is the action site of thalidomide in treating CD, thalidomide binding to CRBN protein leading to downregulation of PI3K/Akt/mTOR pathway, this thalidomide-CRBN-mTOR axis plays an important role in the treatment of thalidomide in CD. Therefore, in this study we plan to prospectively recruited refractory CD patients treated with thalidomide and use CRBN gene knock-out mice and CRBN gene knock-down human intestinal epithelial cell strain to investigate the value of CRBN being the action site of thalidomide and in predicting the response of thalidomide in treating refractory CD; and to explore the role of Thal-CRBN-mTOR axis in CD treated with thalidomide. Experimental techniques including qRT-PCR、siRNA、Westen blot、cell isolation and cell culture will be adopted to accomplish the study.

文献报道及我们前期研究显示沙利度胺（Thal）有效治疗难治性克罗恩病（CD），但机制不明。新近发现Cereblon（CRBN）蛋白是Thal的作用靶点，Thal与CRBN结合激活CRLE3复合体泛素连接酶活性，进而影响其下游PI3K/Akt/mTOR（mTOR）通路。结合我们前期研究发现活动性CD患者存在mTOR通路激活、下调该通路可减轻小鼠结肠炎症。由此我们提出假设：CRBN是Thal治疗CD的作用靶点，Thal与CRBN结合后下调 mTOR通路有效治疗CD。本项目拟前瞻性纳入难治性CD患者、并利用CRBN基因敲除小鼠及人肠上皮细胞株，采用qRT-PCR、siRNA、免疫印迹、细胞分离培养等方法，探讨CRBN蛋白作为Thal治疗CD的“作用靶点”以及预测Thal疗效的“生物标志物”的价值；明确mTOR通路变化与Thal疗效及CRBN表达间的关系。旨在探讨CD发病机制及寻找可能的治疗靶点。

克罗恩病是一种累及全消化道的慢性反复发作的炎症性疾病，病因和发病机制未明，缺乏有效的根治手段，沙利度胺属于一种较为特殊的免疫调节剂，在治疗克罗恩病的研究较为初步，且其治疗克罗恩病的机制未明。Cereblon蛋白（CRBN）是一种具有离子蛋白酶活性的大脑相关蛋白，被认为是沙利度胺的致畸靶点。沙利度胺的多种临床效应可能均始动于与CRBN蛋白的结合，影响E3泛素连接酶活性的复合体的E3泛素连接酶活性，进而影响其下游的通路发挥作用。本项目主要围绕沙利度胺治疗克罗恩病展开，就沙利度胺治疗难治性克罗恩病及其并发症的疗效、可能影响药物不良反应发生的原因以及其发挥疗效可能的作用靶点和作用机制进行了研究，取得了以下研究成果。第一，沙利度胺治疗难治性克罗恩病的短期及长期疗效分析。结果发现：沙利度胺能够有效维持难治性成人克罗恩病的临床缓解，中重度患者复发风险增加，沙利度胺的不良反应是限制其使用的主要原因；第二，沙利度胺治疗克罗恩病肛瘘及肛周脓肿的疗效及安全性分析。沙利度胺对克罗恩病肛瘘及肛周脓肿治疗有效，使用硫唑嘌呤无效的克罗恩病肛瘘及肛周脓肿患者，加用沙利度胺后亦有一定疗效，且沙利度胺可以应用于此类合并感染的患者而不会使得感染扩散；第三，鉴于沙利度胺通过细胞色素P450 2C19（CYP2C19）转化为5-羟基沙利度胺（5-OH）和顺-50-羟基沙利度胺，我们通过检测CYP2C19基因的快代谢型和慢代谢型，发现CYP2C19基因多样性与沙利度胺治疗克罗恩病疗效和不良反应无明显因果关系；第四，CRBN在克罗恩病中的表达情况研究，克罗恩病患者肠道组织下CRBN水平高于正常对照，沙利度胺治疗后CD患者肠道组织CRBN水平明显低于沙利度胺治疗前，提示了CRBN作为预测沙利度胺治疗CD疗效预测标志物的潜在价值。总体来说，本研究肯定了沙利度胺治疗难治性克罗恩病及其并发症的疗效，为临床治疗提供了很有价值的证据，且我们排除了其中一种肝酶的基因型对于药物疗效和不良反应的影响，提出CRBN作为预测沙利度胺治疗CD疗效的标志物的应用前景。