文冠果较长静止期合子的发育和分裂研究

The cross-fertilized zygotes of Xanthoceras sorbifolium Bunge, an oil tree native to north China, have a relatively long resting period (12-13 d), after which they can be recognized as two kinds: those that will not divide, and those will divide. The young fruits with non-dividing zygotes will abort, and the fruit set of the tree would suffer. Based on previous work, this project will focus on the studies of the division and development of the zygote of relatively long resting period. Using histological sectioning and microtechnique, isolation of cells from embryo sac by microdissection and laser microdissection, construction of cDNA library and DNA sequencing, suppression subtractive hybridization, endogenous auxin analysis and exogenous auxin treatments, the project will investigate (1) cytological characters of the cross-fertilized zygote of different stages, (2) gene expression profiling of eggs, zygotes and 2-celled proembryos and zygotic genome activation, (3) differential expression genes of two kinds of zygote, (4)relationship between auxin and the division and development of zygote. The aims of these studies are to characterize the development and devision of zygotes with relatively long resting period and to determine the mechanisms of formation of dividing and non-dividing zygotes after the resting period. The studies of this project will not only fill in the gap of studies on the zygote with relatively long resting period in plant embryology research area, but also will be significant for the research of improvements of fruit set in X. sorbifolium.

文冠果是我国北方珍贵的木本油料资源植物，其杂交传粉后，合子在经历较长静止期后（12-13 d）才进入分裂。合子静止期后出现能分裂和不能分裂两种类型，不能分裂合子的幼果会较早落果而影响座果率。基于前期研究，本项目首次聚焦较长静止期合子的发育和分裂问题，采用组织切片、显微解剖和激光显微切割系统分离胚囊内细胞、cDNA文库构建与测序、抑制差减杂交、生长素分析及处理等手段，深入研究文冠果杂交合子（1）不同时期的细胞学特征；（2）卵细胞、合子及2细胞原胚的基因表达谱及合子基因组激活；（3）两种类型合子的差异表达基因；（4）生长素与合子发育和分裂的关系。通过这些研究，阐明较长静止期合子的发育和分裂特征，确定静止期后能分裂和不能分裂两种类型杂交合子产生的机理。本项目不仅填补植物胚胎学对较长静止期合子的研究空白，而且对提高文冠果座果率的研究也具有重要意义。

文冠果合子从形成到第一次分裂有相当长的静止期，本项目从细胞学与分子调控角度研究了其发育过程。我们采集授粉后不同发育时期的胚珠，通过石蜡切片、半薄切片与超薄切片以及TUNEL实验检测，研究了不同发育时期合子细胞的形态结构及染色体变化，探讨不同合子的发育命运。确定了正常发育合子第一次分裂的精确时间（授粉后12~13 d）和异常合子败育的时间（大多数在授粉后2~8 d）。合子败育以前，细胞内的线粒体和内质网等亚显微结构首先出现异常。我们对自交与杂交受精后胚珠进行了转录组学研究，鉴定274个基因在自交胚珠中特异或偏好性表达，42个基因在杂交胚珠中特异或偏好性表达，鉴定3812个预测编码转录因子（TF）基因。通过石蜡切片与激光显微切割技术相结合，获取受精前的卵细胞、不同发育时期合子及游离核胚乳，研究这些特异细胞或组织的转录表达谱。基于转录组学研究，我们鉴定了5个与受精后胚珠发育相关的超氧化物歧化酶基因（SOD）和1个CuZnSOD伴娘基因（CCS），克隆了这些基因的全长cDNA序列、基因组序列和启动子序列，分析了这些序列特征和顺式作用元件等，研究了这些基因在受精后不同发育时期胚珠的转录表达以及这些基因编码的酶的活性。通过病毒诱导基因沉默技术、异位转基因表达以及RNA原位杂交技术，研究了XsMSD基因功能。结果表明，XsMSD转录水平减少，将直接导致胚珠及幼果败育。大量证据表明，文冠果SOD基因与胚珠及合子发育命运（正常发育或败育）密切相关。本项目首次研究了较长静止期合子发育的细胞及分子机理，探讨了受精后胚珠及幼果败育的机制。这些研究不仅促进对文冠果生殖生物学的理解，而且对提高文冠果坐果率的生产实践也具有重要指导意义。