不同环境压力状态下粪肠球菌生物膜特性研究

粪肠球菌是导致根管治疗失败、根管治疗后疾病发生的最主要微生物之一，对其特性的研究已成为口腔医学界关注的焦点。在粪肠球菌的诸多毒力因子中，具有极强的对不利环境压力的抵抗能力是其能够在营养物质缺乏、高碱性、抗菌药物存在等恶劣环境中继续生长、繁殖，引发根管内慢性感染的关键。. 本研究拟模拟根管治疗后根管内环境压力状态，体外建立粪肠球菌在高碱、饥饿及抗生素存在三种环境压力状态下的生物膜模型，采用定量分析方法观察生物膜生化组成变化，运用激光共聚焦显微镜和Amira? 4.1.1软件对三种不同环境压力状态下的粪肠球菌生物膜三维结构进行动态观测，了解不同压力状态下粪肠球菌生物膜代谢的自然生理过程及三维结构的异同；并在此基础上，通过对粪肠球菌在上述三种环境压力作用下的代谢组学研究，探索其抵抗极端环境压力的机制，为研究粪肠球菌及其生物膜在根管再感染中的作用机制及药物干预提供实验依据。

在课题组成员通力合作下，该项目按照研究计划顺利稳步进行，获得主要研究进展如下：.1.在体外成功构建出不同环境压力状态下粪肠球菌生物膜模型.采用粪肠球菌标准菌株ATCC33186，分别摸索高碱、饥饿及次氯酸钠浓度及培养条件，经过反复实验验证，成功在体外构建出高碱性环境状态、饥饿状态及次氯酸钠存在状态下的粪肠球菌生物膜模型，结果显示生物膜模型可行，完全可应用于环境压力状态下粪肠球菌生物膜的各项研究，为顺利进行后续实验构建了平台。 .2.完成不同环境压力状态下粪肠球菌生物膜生物化学成分分析 .采用生物化学分析方法分别对高碱、饥饿及次氯酸钠存在状态下粪肠球菌生物膜在特定时间点的生物膜化学成分进行了动态分析，包括生物膜干重、总蛋白、水溶性多糖、水不溶性多糖、细胞间多糖的测定；并在此基础上分析其化学成分组成的差异。初步了解了三种不同环境压力下，粪肠球菌生物膜生长、代谢过程中，成分和结构的变化。.3.摸索出提取和测定粪肠球菌生物膜总蛋白的最佳方法.分别采用了三种不同方法提取和测定粪肠球菌生物膜总蛋白，对其含量和质量进行比较分析，最终确定了提取和测定粪肠球菌生物膜总蛋白的最佳实验方案，从方法学角度为其他学者进行相关科学研究提供了可借鉴的方法。.4.完成了激光共聚焦显微镜对不同环境压力状态下粪肠球菌生物膜形成的动态观察及三维结构重建.使用SYTO 25荧光标记细菌，摸索、优化最佳激发波长及发射波长等参数，取24、48、72小时作为观测时间点进行激光共聚焦显微镜动态观察并进行三维结构重建，获得了完整的粪肠球菌生物膜由形成初期至末期的生长过程生物膜结构变化资料，初步了解了粪肠球菌生物膜在不同压力状态下代谢的自然生理过程。.5.完成代谢组学研究.培养与收集粪肠球菌生物膜在高碱、饥饿、次氯酸钠存在的三种环境压力状态下菌细胞；淬火终止其代谢过程，提取胞内代谢产物；气相色谱和质谱联机( GC/MS )分析：通过分析获得每个峰的质谱，得到部分差异代谢产物，已完成代谢产物分析工作。.6.发表论文及会议交流.目前已发表核心期刊论文1篇，已修回SCI收录论文1篇，已投出SCI收录论文1篇；参加国际会议一次，国内会议一次。.7.研究生培养：准备答辩研究生两名，拟答辩时间：2014年5月。.8.在本课题研究的基础上，成功申请到2014年国家自然科学基金青年-面上连续项目一项。