基于巯基定量化学蛋白质组学分析抗生素介导细菌ROS的应激响应机制

Antibiotics can induce a cascade of reactive oxygen species (ROS) in bacteria. Bactericidal antibiotics with diverse targets have been hypothesized to kill bacteria, in part by inducing production of damaging reactive species. Deeper understanding of antibiotic-induced bacterial death is critical to identifying means for enhancing our current antibiotic arsenal. In preliminary study, we analyze the reactivity of thousands of cysteines toward ROS induced by different antibiotics and find that most of the redoxome varies dramatically between different antibiotics. In this project, we’ll first systematically and quantitatively analyze ROS reactivity with cysteines across Escherichia coli proteome induced by different antibiotics. Then, we’ll construct network between thiol oxidation and biological effects of antibiotics. Finally, we’ll utilize multiple biology approaches to investigate biological functions of important redox-sensitive proteins and elucidate the mechanism of oxidative damage by antibiotics based on thiol oxidation modification. Taken together, this project is not only of great significance to elucidate the mechanism of the oxidative damage to bacteria by antibiotics, but also provide new ideas for therapeutic methodologies to increase antibiotic effectiveness and drug resistance.

抗生素可诱导细菌产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）而造成氧化损伤，ROS的积累可以增强抗生素的杀菌效果。阐明细菌对于现有抗生素的内在响应机制对于增强现有抗生素的杀菌效果、优化治疗方案具有迫切的现实意义。本课题组在前期初步发现多种抗生素均能诱导ROS产生，导致巯基蛋白质组发生不同程度的氧化。本项目将（1）以大肠杆菌E.coli MG1655模式菌株为研究对象，利用定量化学蛋白质组学技术全面分析由不同抗生素引起的ROS介导的巯基氧化修饰蛋白质组；（2）分析由抗生素引起的ROS导致巯基蛋白质组氧化修饰的方式、位点；（3）构建基于巯基氧化修饰的抗生素-生物学效应网络；（4）最终对获得的重要、感兴趣的巯基氧化修饰蛋白进行生物学功能探究。本项目对于阐明抗生素对生物体的氧化损伤机理有重大意义。另一方面，本项目也为现有抗生素增效以及对抗耐药性的策略提出提供新的思路。

抗生素可诱导细菌产生活性氧而造成氧化损伤，阐明细菌对于现有抗生素的内在响应机制对于增强现有抗生素的杀菌效果、优化治疗方案具有迫切的现实意义。本项目以大肠杆菌MG1655为研究对象，选取了10种具有不同抑菌机理的抗生素对E.coli进行处理。结果表明：抗生素加入后抑制了菌株不同程度的生长，其中以polyB、Rif、Nor和Erm最为明显。随后通过探针标记、点击化学和Western blot检测确定抗生素可引发菌株体内巯基不同程度的氧化。为了更系统了解抗生素诱导ROS如何影响巯基蛋白质组，我们建立了针对大肠杆菌体内巯基蛋白质组分析的化学蛋白质组平台-QTRP。最终我们鉴定到了656个蛋白上1034个半胱氨酸，其中493个蛋白上的710个位点发生了氧化。我们利用uniprot数据库对所鉴定到的氧还敏感半胱氨酸进行功能注释，发现发生氧化的蛋白参与重要的功能，比如G3P1_C150,THIO_C33,TPX_C61，GUAC_C186等。我们进一步对所鉴定到的氧化敏感半胱氨酸进行DAVID分析，发现这些蛋白可参与广泛、重要的生理过程，包括氨基酸合成与代谢、葡萄糖代谢（能量代谢）以及氧化还原平衡维持等。综合分析，我们认为，由抗生素介导的菌株体内ROS的产生从而导致菌株死亡是一条共通的机制。我们在QTRP平台的基础上，开发了针对巯基硫巯基化修饰鉴定的化学蛋白质组学平台Low-pH QTRP，我们利用该技术，发现人源细胞中经NaHS刺激后有994个蛋白的1547个位点发生硫巯基化修饰。该数据集确定了许多H2S调控的新的蛋白靶点。随后，我们拓展了本项目建立的QTRP平台应用，我们分析了5mM H2O2处理5 min后线虫体内半胱氨酸氧化还原形式的变化情况。最终，我们在2864个蛋白上鉴定到5454个Cys-SH位点。我们重点研究了SEK-1和PMK-1是否在p38 MAPK介导的应激反应和病原体抗性中发挥氧化还原调节的作用。我们构建了点突变线虫模型，结合生化分析，发现PMK-1的C173和SEK-1的C213均参与氧化应激介导的p38 MAPK通路激活，并且后者对线虫抵御病原体也至关重要。本项目为现有抗生素增效以及对抗耐药性的策略提出提供新的思路。同时本项目的研究成果将为后续研究巯基氧化修饰的功能提供技术支撑和数据资源。