肝脏CGI58通过IRSI影响mTOR-自噬通路缓解非酒精性脂肪肝的机制研究

Autophagy plays an important role in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), but the mechanism of regulation is still not clear.Our previous study found that when the lipid droplet-associated protein CGI58 is knocked out in the liver, it caused liver degeneration, non-alcoholic steatohepatitis and insulin resistance, and the expression of insulin receptor substrate I (IRSI) and mTOR increased, but the autophagy marker LC3 decreased.Based on the IRSI is a PI3K-Akt-mTOR upstream regulator, we speculate that CGI58 regulates autophagy through IRSI-regulated PI3K pathway.In this project, we first constructed a Raptor/CGI58-LivKO double-knock model on the basis of CGI58 knockout animals to detect liver steatosis after mTOR inhibition.Then, CGI58 and IRSI high expression vectors were used for transfection to detect the effects of CGI58 and IRSI up-expression on mTOR, autophagy, and hepatic steatosis in CGI58-KO model and cells.Finally, by adding PI3K inhibitors to study whether PI3K-Akt-mTOR plays a key role in CGI58-induced autophagy, the results of this study will provide new clues for elucidating the pathogenesis of NAFLD.

自噬在非酒精性脂肪肝（NAFLD）发病中发挥着重要作用，但调控机制尚不明确。我们前期发现，肝脏中脂滴相关蛋白CGI58敲除后，会引起小鼠肝脏脂肪变性和非酒精性脂肪肝炎并伴随胰岛素抵抗，胰岛素受体底物I（IRSI）表达升高，mTOR表达升高，自噬标志物LC3减少。而IRSI是PI3K-Akt-mTOR上游调控因子，据此我们推测CGI58通过IRSI调控PI3K通路调节自噬。本项目拟在CGI58敲除动物和细胞基础上，构建Raptor/CGI58-LivKO双敲模型，检测抑制mTOR后肝脏脂肪变性指标，然后利用CGI58和IRSI高表达载体进行转染，检测在CGI58-KO中分别恢复CGI58和IRSI表达对mTOR、自噬和肝脏脂肪变性指标的影响，最后通过添加PI3K抑制剂，研究PI3K-Akt-mTOR是否在CGI58影响自噬过程中发挥关键作用，本研究结果将为阐明NAFLD发病机制提供新线索。

非酒精性脂肪肝是最常见的肝脏疾病，其流行率约为 25%-40%，其是目前高发病率的慢性病之一。因此，明确非酒精性脂肪肝的发病机制对临床防治具有重要意义。自噬在非酒精性脂肪肝发病中发挥着重要作用，但调控机制尚不明确。我们前期研究发现，肝脏质地相关蛋白CGI-58缺失不但可以引起肝脏脂肪变性还导致了氧化应激，诱发了非酒精性脂肪肝。那么CGI-58作为脂质分解的共激活剂，在肝脏中是否通过自噬加重了“第二次打击”作为脂质特异性巨自噬激活剂引起非酒精性脂肪肝炎尚不清楚。因此，本课题通过肝脏特异性敲除CGI-58并以不同周期的高脂饮食诱导，获得早晚期非酒精性脂肪肝小鼠模型，通过分子生化等手段探讨自噬在肝脏特异性敲除CGI58后引起非酒精性脂肪肝的作用。本课题组通过病毒AAV8病毒注射及Cre-loxp技术获得了多批早期及晚期非酒精性脂肪肝模型小鼠，并对其血糖、体重、血液脂质及肝脏脂质进行了检测，发现肝脏特异性敲除CGI-58经8周饮食诱导引起血液甘油三酯和游离胆固醇显著升高，同时肝脏甘油三酯和总胆固醇也有显著差异。14周模型小鼠血液中总胆固醇也显著升高。然后不同时期的非酒精性脂肪肝的组织经油红O 、苏木精 - 伊红染色法、天狼星红染色等方法鉴定，肝脏表现不同程度的脂质沉积及炎症表现，诱导14周还表现纤维化。进一步蛋白检测8周饮食诱导的模型小鼠肝脏组织后发现自噬标记物P62和LC3II有差异，胰岛素受体底物1和2均有差异。为进一步明确非酒精性脂肪肝的发病机制提供理论依据。