Oct4泛素连接酶在发育多能性的建立和维持中的作用及机制研究

Oct4, a core transcriptional factor, plays a pivotal role in regulating pluripotency and self-renewal of embryonic stem cells (ESCs), and its expression level determines the cell state and differentiation fate of ESCs. However, the molecular mechanisms by which Oct4 protein level is precisely controlled remains elusive. Previously, our study demonstrated that Wwp2 represses the transcriptional activity and protein level of Oct4 along with the induced differentiation process towards primitive endoderm. Later, we found that Wwp1 and Itch, E3 ubiquitin ligases, catalyze Oct4 ubiquitination specifically, and might maintain self-renewal of ESCs by modulating protein level and transcriptional activity of Oct4. Due to function compensation among Wwp1, Wwp2 and Itch, we will study how they coordinate to regulate the establishment and maintenance of pluripotency in ESC and induced reprogramming process. Furthermore, we plan to investigate whether Wwp1, Wwp2 and Itch regulate the protein level and transcriptional activity of Oct4 during the early embryo development process by utilizing the double or triple gene knockout mice. This study will help to unveil the regulatory function of Wwp1, Wwp2 and Itch- catalyzed ubiquitination on Oct4 during early embryo development, and open new avenues for ESC amplification and induced differentiation toward specific cell lineages.

Oct4是调控胚胎干细胞多能性与自我更新的核心转录因子，其表达水平是决定细胞状态和分化方向的重要因素。我们以前的研究证明E3泛素连接酶Wwp2能特异性地催化Oct4的泛素化修饰。最近，我们发现与Wwp2同一家族的Wwp1与Itch也能特异性地催化Oct4的泛素化修饰。前期研究提示Wwp1、Wwp2与Itch可能在不同的细胞状态下调节Oct4的蛋白水平与转录活性，并参与发育多能性的调控。 此外，这三个连接酶之间可能存在功能上的补偿和表达水平的相互调控。基于这些新的发现，本项目拟深入研究这三个连接酶在调控Oct4蛋白质水平，胚胎干细胞自我更新以及体细胞重编程过程中各自的作用及相互关系。同时，利用Wwp1、Wwp2与Itch基因双敲除或三敲除的小鼠模型，研究它们在小鼠发育过程中的作用与调控机制。该研究项目将有助于揭示Wwp1、Wwp2和Itch在早期胚胎发育过程中的重要生理功能。

多能干细胞包括胚胎干细胞与诱导性多能干细胞，具有无限增殖的特性和分化成为机体内任何种类细胞的潜能，是新药筛选和细胞治疗理想的细胞来源和研究模型，因此在再生医学领域展现出广阔的应用前景。但是，多能干细胞多能性的建立、维持和分化的调控机制尚不清楚，阻碍了其临床应用。已有的研究表明由转录因子、信号通路与表观遗传修饰等组成的调控网络共同决定了多能干细胞的状态。其中，核心转录因子Oct4的蛋白水平能够决定多能干细胞的命运。我们之前的研究发现在诱导多能干细胞定向原始内胚层谱系分化的过程中，Wwp2催化Oct4的泛素化修饰，促进泛素化修饰的Oct4经由26S蛋白酶体途径降解，从而迅速下调Oct4的蛋白水平，保证分化事件的正常进行。为了进一步研究Oct4泛素化修饰的功能与作用机制，我们通过质谱分析鉴定了Wwp2催化Oct4泛素化修饰的5个赖氨酸位点。在本项目开展过程中，我们发现突变这5个位点（Oct4-5R）不影响胚胎干细胞自我更新状态，而在诱导多能性重建过程中，可以提高近十倍的诱导重编程效率。分子机制研究方面，我们发现在诱导体细胞重编程过程中泛素分子结合位点的突变提高Oct4的蛋白稳定性，并且促进Ash2l转录本b的表达，提高H3K4甲基化修饰水平，从而促进重编程事件的发生。同时，我们还证明Oct4的下游基因Ash2l转录本b能提高诱导性重编程的效率，并在诱导分化的条件下发挥抑制分化的作用，而Ash2l转录本a则发挥促进内胚层分化的功能。综上，我们通过突变Oct4的泛素化修饰位点，提出一个更高效快捷的诱导体细胞重编程方法，并发现在诱导多能性建立和分化过程Ash2l两个转录本的不同功能，为揭示核心转录因子和表观遗传修饰在多能干细胞中的调控机制提供了新思路。