肉桂醛抗食品腐败菌的靶基因筛选和验证

食品防腐剂的应用对整个食品行业乃至我国国民经济的发展发挥着举足轻重的作用。随着人们对食品安全性的认识和要求逐步提高，化学防腐剂受到严峻挑战，食品防腐剂的天然化已成为各国科技工作者研究的热点。然而，多年来对天然食品保鲜剂的研究始终停留在抑菌活性上，对抑菌机理，尤其是分子机制的研究却鲜有报道。由于它们的抑菌机制不清楚，限制了其开发应用。本课题将利用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌基因芯片进行肉桂醛抗菌分子机制研究，探索肉桂醛对模型菌金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922基因表达的影响，并通过荧光定量PCR验证芯片结果，Western-blot验证芯片锁定的靶蛋白；电镜技术和流式细胞术观察肉桂醛对菌体细胞微观结构的影响，最终阐明肉桂醛对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的分子作用机制，为天然食品防腐剂的抑菌作用机制研究开辟新的思路，也对我国开发具有自主知识产权的食品防腐剂奠定理论基础。

本项目按照研究计划，首先利用微量稀释法测定肉桂醛对模型菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为0.31mg/mL，筛选出与肉桂醛有协同作用的其他天然抑菌成分香芹酚，协同浓度为各0.16 mg/mL混溶。本项目选择2MIC作为最佳处理浓度作用菌体细胞，利用定制的基因芯片分别筛选出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在肉桂醛胁迫下的转录组变化。以Log FC≧2.0为标准，大肠杆菌差异表达基因共247个，其中上调的基因共140个，占56.7%，下调的基因共107个，占43.3%；金黄色葡萄球菌差异表达基因总共229个，其中上调118个，占51.5%，下调111个，占48.5%。利用Genemap、TreeView、NCBI、KEGG和DAVID等数据库对差异表达基因进行了功能聚类分析，大肠杆菌的差异表达基因包含14大类，分别为碳水化合物及相关分子代谢类基因、氨基酸及相关分子代谢类基因、未知功能类蛋白、细胞壁结构基因、RNA合成相关基因、非典型条件适应性基因、DNA 修复和修饰类基因、脂类代谢基因、蛋白合成类基因、DNA包装隔离基因、DNA复制基因，核苷酸和核酸代谢类基因、细胞分裂、氨基酸转录子基因。金黄色葡萄球菌差异表达基因主要包括15个功能类别，包括辅酶和辅基代谢类基因、氨基酸和相关分子代谢类类基因、DNA复制基因、DNA修饰和修复基因、环境适应性基因、细胞壁、细胞分裂、脂类代谢、核酸和核苷酸代谢、噬菌体相关功能基因、蛋白折叠、蛋白分泌、蛋白合成、RNA合成、RNA修饰。RT-PCR和Western-blot验证了芯片结果的正确性。项目利用透射电镜和扫描电镜完成了对细菌微观结构的观察和分析，利用菌悬液电导率、UV260紫外吸光值和β-半乳糖甘酶活性测定肉桂醛对细胞膜结构的影响。结果表明，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对肉桂醛更敏感。初步探讨了肉桂醛抗菌的机制为：①肉桂醛能够破坏细菌的鞭毛蛋白组装系统，从而有效抑制其活性，以及粘附和侵袭力；②阻断细菌DNA的合成；③肉桂醛抑制了菌体细胞壁荚膜多糖的合成而降低了细菌的生存力；④肉桂醛破坏了细菌生物膜的结构和通透性。本项目的大量研究数据为后续研究和生产实践提供了参考依据。