原生动物嗜热四膜虫自噬相关基因ATG4在亲本大核选择性自噬过程中的功能分析

Programmed nuclear death (PND) of parental macronucleus during conjugation is required for the completion of the development of sexual reproduction in the ciliated protozoan Tetrahymena thermophila. The PND of Tetrahymena is a type of selective autophagy, but the molecular mechanism of the selective autophagy is not clear. In this study, ATG4-1 and ATG4-2, the members of autophagy-related genes (ATGs) family, were screened based on Tetrahymena Genome Database (TGD) and Tetrahymena Functional Genomics Database (TetraFGD). Dynamic localization of HA/V5/GFP-tagged Atg4 in mating Tetrahymena cells will be obtained using specific antibody by immunofluorescence staining. The function of the autophagy-related genes ATG4 in the PND will be analyzed by gene knockout, gene knockdown and gene overexpression methods. The interactions between Atg4 and Atg8 will be analyzed by co-localization or co-immunoprecipitation. The key regulatory factors of selective autophagy of parental macronucleus will be discovered by identifying ATG4 signaling pathway-related genes using transcriptome sequencing analysis of ATG4 mutant cell lines. Based on the data, the molecular mechanism of selective autophagy of parental macronucleus in Tetrahymena will be further clarified, and the study will strengthen our understanding for the molecular mechanism of selective autophagy from the perspective of unicellular eukaryotes.

纤毛类原生动物嗜热四膜虫有性生殖时期亲本大核发生的程序化核死亡（Programmed nuclear death，PND）对细胞有性生殖发育完成是必需的。亲本大核PND是一种独特的选择性自噬，然而其具体的分子调控机制仍不清楚。本研究基于四膜虫大核基因组数据库和功能基因组数据库，筛选自噬基因家族成员ATG4-1和ATG4-2，构建含有HA、V5和GFP等标签融合基因的突变体细胞株，免疫荧光定位分析自噬相关基因ATG4表达产物Atg4的定位模式；通过基因敲除、RNA干扰和过表达技术，分析比较ATG4突变对亲本大核选择性自噬的影响，免疫共沉淀技术分析Atg4与Atg8是否存在相互作用；通过对ATG4突变细胞株的转录组测序分析，鉴定ATG4信号通路中相关基因，揭示调控亲本大核选择性自噬的关键因子。为阐明四膜虫亲本大核选择性自噬分子调控机制，从单细胞真核生物角度认识选择性自噬的分子机制提供科学依据。

存在于原生动物嗜热四膜虫有性生殖过程中的亲本大核程序性降解（PND）是一种独特的选择性自噬类型。自噬相关基因Atg8是亲本大核PND过程重要的调控因子。然而PND的分子调控机制仍然不清楚。本研究通过分析嗜热四膜虫基因组数据库和功能基因组数据库，筛选鉴定了自噬相关基因ATG4.1、TG4.2、ATG4.3、ATG4.4及ATG5。通过构建含有HA融合标签基因的突变体细胞株，间接免疫荧光定位分析获得不同基因表达产物在有性生殖阶段的亚细胞定位模式。结果表明，四个同源自噬相关蛋白Atg4及Atg5在PND阶段都能够定位于亲本大核，参与调控PND过程。在本项目中，为了进一步揭示PND分子调控机制，我们首先聚焦同源自噬蛋白Atg4.1和Atg4.4的功能分析。在ATG4.1与ATG4.4过表达细胞株PND阶段能够观察到亲本大核异常膨大。过表达ATG4.4后小核减数分裂产物无法正常降解，并且配对细胞向anlagen阶段发育受到阻碍；在进入anlagen阶段的配对细胞中，亲本大核向细胞底端的迁移被阻碍。敲减ATG4.1后，在PND阶段核心自噬相关蛋白Atg8不能顺利定位于亲本大核上；亲本大核也无法正常凝缩并且降解延迟，其的酸化虽然不受影响，但核膜受损破裂；分布在受损亲本大核周围的自噬溶酶体的体积显著增大。ATG4.4表达缺失，核选择无法进行；小核减数分裂产物全部异常降解，配对细胞无法发育至anlagen时期。这些结果表明自噬相关蛋白Atg4.1与Atg4.4在参与调控PND过程中都与亲本大核的凝缩相关。同时，这两种同源自噬相关蛋白存在功能差异。Atg4.1特异的只参与调控亲本大核PND。相比之下，Atg4.4不仅参与调控亲本大核PND，并且在小核减数分裂产物降解过程中发挥重要作用。此外，Atg5同样参与调控小核减数分裂产物和亲本大核的程序性降解。通过分析Atg5敲减细胞株中Atg8.2的定位与表达，以及免疫共沉淀实验都证实Atg5对Atg8.2在亲本大核PND过程中功能的发挥具有调控作用。本研究通过对四膜虫中自噬相关蛋白Atg4.1、Atg4.4以及Atg5的功能分析进一步揭示了亲本大核PND过程的分子调控机制，为深入理解选择性自噬机制提供了新的科学数据。