IPS细胞--肿瘤细胞体外精密实时微环境控制芯片实验室新技术研究

For both researches and applications，the microenvironments of stem cells are essential for the stem cell's maintenance, proliferation, differentiation and canceration. However, real-time precisely controlling the microenvironments or niches of cells in vitro is still an unsolved but essential technique which must be broken through in life science researches. We have developed a series of techniques for on-chip microenvironment controlling and on-chip experiments, including single cell or multi-cell retention, tracking, culture, fluorescent signal extraction, gas exchange and its gradient controlling on a glass microchip and so on. The preliminary studies showed that if chemical microenvironments of cells could be well controlled，on line image recording could show the many kinds of movements of cells (cancer cells, bone marrow cell or macrophage). These video clips, which also showing the cells' differentiation, chemotaxis for gas gradient, macrophage's movements, macrophage's actions of cell transporting, delivering and other cell-cell reactions, proves the priority of lab-on-a-chip on cell researches. For the first time, this proposal is intent on quantificationally studying the iPS cell's microenvironment for the whole detail processes to cancer stem cell. This study hope to achieve a series of precise methods for cell microenvironment controlling and to establish an experimental technology platform to study the maintenance, proliferation, differentiation and canceration of stem cell, furthermore searching for the critical inducible factors responsible for iPS cells' transformation into cancer stem cells.

就干细胞研究及应用而言，其所处的微环境对于干细胞的维持、增殖、分化、癌变等都起着至关重要的作用。而体外细胞微环境的精密实时控制始终是生命科学研究上必须突破的技术瓶颈。申请人针对细胞微环境发展了一系列新的芯片实验室技术，包括：单细胞及多细胞的保留、追踪、培养、荧光信号背景扣除、玻璃芯片内气体交换及气体梯度控制等。前期研究表明，肿瘤细胞、巨噬细胞等在芯片上的化学微环境能较好地被控制，细胞的运动能很好地被追踪记录，并可在芯片上观察到细胞的分化，巨噬细胞的趋化，细胞间运动接触、搬运及颗粒呈递等动态现象，显示出芯片实验室技术在直接观察微环境与细胞互动现象方面所具备的独特优势。本研究首次将以诱导多功能干细胞（iPS）-癌细胞及其过程（iPS癌化）的细胞微环境为主攻方向，在芯片上研究干细胞的维持、增殖、分化、癌变等过程的精密微环境控制方法及实验技术平台，并寻找iPS转变为癌干细胞的关键诱导因子及方式。

本项目发展一系列微环境控制新技术来开展干细胞--肿瘤细胞直接动态观察研究，发现干细胞在近距离会诱导肿瘤细胞定向穿膜侵袭，找到了一系列干细胞在近距离诱导肿瘤细胞恶化并转移的显微动态观察及分子生物学证据，并进一步提出了假说，认为干细胞聚集在肿瘤周围，恶化肿瘤细胞并将其诱导出肿瘤的过程可能是肿瘤突破生长区域开始转移的关键时间点。.1干细胞在700μm远诱导大量肿瘤细胞主动向干细胞方向穿过膜上的8μm孔到达另一侧。如果干细胞不在膜孔的另一侧，则肿瘤细胞就不会通过孔进行穿膜运动。.2 近距离的干细胞降低了肿瘤细胞的凋亡率，提高了肿瘤细胞的增殖率。.3 发展了在基质胶块中培养干细胞和肿瘤细胞的实验方法，肿瘤细胞在基质胶中的立体环境中生长为球形细胞克隆。.4基质胶外的干细胞能诱导基质胶内的肿瘤细胞钻出基质胶。.5干细胞诱导肿瘤细胞破坏基质胶让其呈现出瓦解的形态。.6 发展了在孔板中布设细胞株的基质胶点阵，并用基质胶进行全覆盖共培养并全孔拍摄记录，24-72干细胞对肿瘤细胞的诱导范围为400μm以内，在这个距离内肿瘤细胞显著而快速地朝干细胞方向运动，同时干细胞也向肿瘤细胞方向运动。.7 干细胞诱导肿瘤细胞MMP-9基因的表达量（mRNA）提高了5.5-6.1倍，这解释了干细胞诱导肿瘤细胞破坏基质的原因。同时波形蛋白N-钙黏素、Snail 、Slug 、Twist、MMP-2 mRNA表达量也略有提高，E-钙黏素mRNA表达量则稍有降低。这表明干细胞的近距离诱导作用导致了肿瘤细胞的EMT转化（上皮－间质转化）也就说被近距有诱导的细胞有恶化为肿瘤干细胞的趋势。.8 发展了可用于研究细胞-细胞相互关系的微泵，其主体1平方毫米，能主动双向输送微流液体。.9 根据研究结果提出假说：干细胞将肿瘤细胞恶化并诱导出来转移可能是肿瘤转移的普遍现象，也可能成为肿瘤转移实际发生的关键时间点，同时因为这是一个在体外控制研究的细胞模型，非常有利于在此基础上研究肿瘤转移机制，肿瘤转移防治药物研究及肿瘤个性化治疗研究的各种新技术新方法。