酒精调控海马组织微环境对骨髓间充质干细胞移植存活的影响及机制

Our previous study (supported by the research grant from the National Program for Key Basic Research Projects of China No. 81060111) has already confirmed that the stereotactic transplantation of bone marrow mesenchymal stem cell (BMMSC) into the hippocampus could effectively improve the learning and memory function of alcohol-associated dementia (AAD) rats, but the implanted BMMSC survival rate in the hippocampus is low, further clarifying the impact mechanism is a key to improve BMMSC treatment effects. We speculate that as a result of BMMSC transplantation in inappropriate time points, the concentration of cell toxic substance in alcohol-damaged hippocampus microenvironment is too high, resulting in implanted stem cell apoptosis to occur quickly. To test this hypothesis, by establishing co-culture models of BMMSC and different hippocampus tissue homogenates (with or without alcohol) or BMMSC and original hippocampus glial cells, we will observe alcohol-induced time-concentration changes in cell toxic substance (such as inflammatory factors, oxygen free radicals) and analyze BMMSC proliferation, apoptosis and its correlation with Wnt signaling pathway in vitro. Moreover, to establish an AAD rat model, BMMSC will be labeled with green fluorescent protein (GFP) and transplanted into the rat hippocampus at different time points. We will continuously observe BMMSC treatment effects, cell survival states, hippocampus glial cells and alcohol-induced time-concentration changes in cell toxic substance (inflammatory factors, oxygen free radicals), further indicating its correlation with Wnt signaling pathway. These findings would provide the experimental reference for the optimal timing of transplantation in treatment of AAD with BMMSC.

我们前期研究（国基81060111，已结题）证实骨髓间充质干细胞（BMMSC）立体定向海马移植能有效改善酒精性痴呆（AAD）大鼠的学习记忆功能，但BMMSC移植存活率低，阐明其影响机制是进一步提高移植疗效的关键。我们推测由于酒精诱导海马损伤使局部微环境细胞毒性物质浓度过高，在不恰当时间点进行移植可导致植入干细胞迅速发生凋亡。为验证该假说，我们建立BMMSC与不同条件海马组织匀浆液（正常/酒精组）及其与原代海马神经胶质细胞的共培养模型，体外观察分析酒精诱导炎性因子、氧自由基等细胞毒性物质的时间-浓度变化对BMMSC增殖、凋亡的影响及其与Wnt信号通路相关性；并且建立AAD大鼠模型，将GFP标记的BMMSC在不同时间点移植至大鼠海马内，动态观察评价BMMSC移植疗效、生存状态与海马神经胶质细胞、炎性因子、氧自由基等因素变化及其与Wnt信号通路相关性，为干细胞治疗AAD提供最佳移植时间选择依据。

近年来广泛开展的干细胞研究取得了显著进展，为各种损伤疾病尤其是不可逆性损伤的治疗提供了新的思路和方法。目前临床干细胞移植的主要途径以静脉注射为主，关于脑内移植的研究较少。然而，研究证实外源性干细胞体内移植一直存在存活率低的问题，这也是制约干细胞临床应用的最大难题。本课题为我们前期研究（国家自然科学地区基金No.81060111，已结题）的延续工作。我们的前期研究已经证实骨髓间充质干细胞（BMMSC）立体定向海马移植能有效改善酒精性痴呆（AAD）大鼠的学习记忆功能以及修复受损的海马组织。然而，在研究中我们发现一个明显的问题是BMMSC移植至损伤海马区后存活率低，其具体机制并不清楚，但该问题的解决是提高干细胞移植疗效的关键。本课题通过建立BMMSC与原代海马神经胶质细胞的共培养模型，全面分析酒精诱导海马局部微环境细胞毒性物质的时间-浓度变化特征及其与BMMSC增殖、凋亡的关系，初步阐明神经胶质细胞在海马微环境调控中的作用及机制，实验结果证实酒精诱导海马损伤后其局部微环境的炎性因子、氧自由基等细胞毒性物质水平随着时间的延长而呈下降趋势；急性酒精损伤对BMMSC移植存活具有明显的抑制作用，随着酒精损伤时间的延长，微环境干扰因素对BMMSC的生长抑制作用逐渐减弱，但仍具有一定的抑制作用。另外，我们通过酒精诱导痴呆动物模型研究，进一步阐明酒精诱导海马损伤后局部微环境的变化特征与BMMSC移植存活的相关性，实验结果提示BMMSC脑内最佳移植时间应尽量避开急性损伤期，过早和过晚移植都不利于干细胞移植存活，并且损伤因素干扰少的微环境有利于干细胞移植存活。我们的研究为临床干细胞移植治疗酒精诱导痴呆患者提供了重要的实验参考依据；另外，许多神经退行性疾病也可导致学习记忆功能损害，如老年性痴呆、血管性痴呆等，本研究成果也可为这些疾病的治疗提供新的思路和方法学参考，因此具有较广泛的临床应用价值。