骨髓间充质干细胞在多发性硬化中对水通道蛋白-4介导的血脑屏障通透性的影响及其机制

Mesenchymal stem cells (MSCs) replacement is a providing hope for multiple sclerosis (MS), a disease lacks effective therapeutic methods；maintain the integrity of blood-brain barrier (BBB) might be a potent therapeutic target of MS. Our previous study indicated that MSCs downregulated AQP4 expression effectively, thus maintained BBB integrity and reduced edema after cerebral ischemia, p38 pathway might participate in the regulation of AQP4 expression. However, the exact mechanism is still unclear. In addition, activating adenosine A2B receptor (A2BR) expressed on astrocyte promotes the phosphorylation of p38 and increased the secretion of inflammatory factors. In multiple sclerosis, effects of MSCs on the permeability of BBB were still unknown. In this research, we intend to explore role of MSCs on the permeability of BBB and illustrate the therapeutic mechanism. Using Evan Blue extravation and enhanced-MRI scan，astrocyte-specific interference test, western blot, immunostaining and so on ,we first explore effects of MSCs on AQP4 expression and the integrity of BBB in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice, then, using primary astrocyte culture model, we try to explore whether adenosine A2B receptor participate in the regulation of AQP4 expression and astrocyte function and the relationship between the activation of adenosine A2B receptor and p38 phosphorylation. Finally, we verify the effects of adenosine A2BR-p38 signal pathway on the regulation of AQP4 expression and BBB integrity. Our project provides a new therapeutic mechanism of MSCs transplantation and might offer a new view on MS therapy.

多发性硬化（MS）仍缺乏有效的治疗手段。骨髓间充质干细胞（MSCs）移植有望成为其有效的治疗手段；维持血脑屏障（BBB）的完整性是多发硬有效的治疗靶点。本申请人的研究结果表明，MSCs 能下调缺血及炎症诱导的水通道蛋白-4（AQP4）的表达，减轻血脑屏障的破坏，p38信号通路可能参与其中，但其确切机制仍不甚清楚, MSCs在维持多发性硬化BBB完整性中的作用及机制仍无报道。本项目拟以实验性自身免疫性脑炎小鼠和原代星形胶质细胞为研究对象，采用Evans Blue 渗漏实验，增强MRI扫描，星形胶质细胞特异性病毒干扰，免疫组化，蛋白电泳等方法，通过体内实验和体外实验，探讨MSCs移植对EAE小鼠AQP4表达以及BBB通透性的影响，阐明腺苷A2BR在其中发挥的作用，明确腺苷A2BR-p38信号通路对于AQP4表达的影响，为MSCs在MS中的治疗作用提供新的理论基础，为MS的治疗提供新的思路。

多发性硬化（MS）是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要表现的自身免疫性疾病，仍缺乏有效的治疗手段。既往研究表明，维持血脑屏障（BBB）的完整性是多发性硬化有效的治疗靶点。本项目拟探讨骨髓间充质干细胞（MSC）在多发性硬化中对于血脑屏障通透性的影响及机制。在体内实验中，实验分为3组：对照组，PBS组，MSC注射组，在造模后第11天尾静脉注射MSC或者PBS，每天评估EAE小鼠的行为学评分以及体重，造模18后处死小鼠，用快蓝染色的方法评估脊髓脱髓鞘情况，HE染色监测炎症细胞浸润，IgG染色以及紧密连接蛋白（ZO-1,Occludin）评估血脑屏障通透性的改变，同时，用蛋白电泳的方法半定量水通道蛋白4（AQP4）以及A2BR的表达情况。在体外培养的原代星形胶质细胞中，用LPS刺激星形胶质细胞，用蛋白电泳的方法评估不同的干预对AQP4以及A2BR表达的情况，同时评估A2BR-P38信号通路对AQP4表达的影响。结果表明，MSC能够减轻EAE小鼠的临床症状，减少脊髓髓鞘的脱失以及炎症细胞的浸润，同时，MSC能够抑制A2BR的表达以及AQP4的表达。体外实验表明，MSC通过抑制A2BR的激活，下调LPS诱导的AQP4的表达，MSC的这种作用是通过调节P38磷酸化而发挥作用的。综上所述，本项目证明了MSC可以通过降低血脑屏障的通透性，从而缓解EAE小鼠的临床症状，这种作用是通过下调星形胶质细胞AQP4的表达而发作作用的，A2BR-P38信号通路在其中发挥调节作用，为骨髓间充质干细胞用于治疗多发性硬化提供新的理论基础。