拟南芥生长素稳态调控的分子机理研究

The cellular auxin homeostasis is one important mechanism by which auxin controls plant growth and development. It is mainly established and maintained via auxin biosynthesis and polar transport. We isolated an enhancer of Arabidopsis pid mutation, g471. pid g471 double mutants do not produce cotyledons during embryogenesis. The expression levels of auxin response reporter DR5-GUS are decreased in pid g471 double mutants. In addition, the subcellular localization and protein levels of PIN1-GFP are abnormal in some embryo cells. These indicate that G471 plays important role in auxin homeostasis. Using map-based approach, we identified a mutation in G471 gene, which encodes a phosphoinositide phosphatase. We confirmed that the mutations in pid and the one we identified caused the developmental defects by complementation and multiple g471 alleles. G471 and its homologous genes may redundantly control auxin-mediated embryogenesis. In this project, we propose to dissect the function of the G471 gene family and a phosphatidylinositol kinase gene family in auxin homeostasis, with emphasizes on their roles in subcellular localization and enzyme activity of PID and PIN1 proteins.

植物细胞内生长素的稳态主要是通过生长素合成和极性运输形成和维持的，是生长素发挥生理功能的一种重要机制。我们通过遗传筛选获得一个拟南芥pid的增强子突变体g471。pid g471双突变体的胚胎子叶完全缺失，幼苗根中生长素报告基因DR5-GUS基因表达降低，胚胎细胞中PIN1-GFP的极性定位和蛋白水平明显异常，说明G471基因在生长素稳态形成和维持中起重要作用。我们利用图位克隆技术分离了G471基因，发现它编码一个磷酸肌醇磷酸酶，互补实验证实发现的突变是导致发育缺陷的原因。G471可能与其同源基因共同控制生长素介导的胚胎发育过程。在本项目中我们将研究G471磷酸肌醇磷酸酶家族和磷脂酰肌醇激酶家族基因在生长素稳态形成和维持中的作用，重点解析它们在PID和PIN1的亚细胞定位和酶活性调控中的作用机理。

本项目的目标是揭示磷酸肌醇磷酸酶基因G471及其同源基因调控生长素稳态的机制，阐明PtdIns、PI4P 和PI(4,5)P2 在控制PIN1 蛋白的表达和极性定位中的作用机理。我们按计划完成了研究内容，发现生长素报告基因在g471 pid双突变体的胚胎发育阶段的子叶原基的表达明显降低；生长素运输蛋白PIN1的极性定位发生明显的改变，在质膜和细胞质中的分布也发生变化。在pid 突变体背景下过量表达PI4K 基因，能够导致子叶缺失表型，说明PI4P在生长素稳态维持中起重要作用。构建了G471基因启动子驱动GFP-G471报告基因表达载体的转基因植株，发现G471蛋白定位于质膜和内膜系统。分别构建并获得了5个PI4K基因的GFP报告基因转基因株系，分析了它们的表达模式。用PI4K的抑制剂PAO 处理，研究PI4P 对PID-GFP 和PIN1-GFP 的影响，发现PAO处理可能影响PID-GFP在质膜上的定位。用囊泡运输抑制剂BFA处理后，发现g471 pid突变体中BFA小体形成速度变慢。G471及其同源基因共同调控胚胎发育，g471与其同源基因的双突变体，在胚胎发育过程中双突变体会产生三个子叶的胚胎。这些胚胎能够正常发育形成种子，萌发后幼苗具有三个子叶。另外部分双突变体的胚胎败育，这些败育胚胎是早期胚胎细胞分裂和发育异常造成的。在上述双突变体胚胎发育过程中，胚根原标记基因WOX5的表达异位。双突变体中生长素响应报告基因表达减弱。g471突变体与其他生长素转运相关突变体之间存在遗传互作。构建了g471 npy1 npy3三突变体，发现它们的成年植株会产生生长素功能缺陷特异的针状花序表型。这些结果表明，G471及其同源基因，通过参与调控囊泡运输，调控生长素极性运输载体PIN蛋白的极性定位，调控生长素极性运输和稳态，从而调控植物的生长和发育。由于生长素是重要的植物激素，而生长素转运蛋白的极性定位是生长素研究领域的热点问题，这些发现对于进一步理解生长素调控植物发育的机理具有重要意义。我们正在对以上研究结果进行整理，撰写论文和投稿发表。